Neuer C8

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1785 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Neue strukturell unterschiedliche Gruppen von C8-substituierten Koffeinderivaten wurden synthetisiert und auf ihre chemischen und biologischen Eigenschaften hin untersucht. Es wurden Massenspektrometrie-, FT-IR- und NMR-Charakterisierungen dieser Derivate durchgeführt. Die zytotoxische Aktivität der Derivate wurde in vitro unter Verwendung menschlicher roter Blutkörperchen (RBC) und in pharmakokinetischen In-silico-Studien geschätzt. Die antioxidative Kapazität der Verbindungen wurde mithilfe eines Eisenionen-Chelatbildungsaktivitätstests analysiert. Die Fähigkeit der Derivate, Erythrozyten vor oxidativen Schäden, einschließlich der Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin, zu schützen, wurde unter Verwendung eines wasserlöslichen 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidin)dihydrochlorids (AAPH) als Standardinduktor von Peroxyl bewertet Radikale. Das Ausmaß des intrazellulären oxidativen Stresses wurde mithilfe der fluoreszierenden Redoxsonde 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass es sich bei allen Derivaten um biokompatible Verbindungen mit einem erheblichen antioxidativen und zytoprotektiven Potenzial handelt, das von ihrer chemischen Struktur abhängt. Um die antioxidative und zytoprotektive Aktivität der Derivate zu erklären, wurden ein Mechanismus des Wasserstoffatomtransfers (HAT), der Radikaladduktbildung (RAF) oder des Einzelelektronentransfers (SET) sowie die spezifischen Wechselwirkungen der Derivate mit dem Lipid untersucht Doppelschicht der RBC-Membran, wurden vorgeschlagen. Die Ergebnisse zeigen, dass ausgewählte Modifikationen des Koffeinmoleküls seine antioxidativen Eigenschaften verstärken, was unser Wissen über die Struktur-Aktivitäts-Beziehung von zytoprotektiven Verbindungen auf Koffeinbasis erweitert.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden bei Stoffwechselprozessen in jeder Zelle konstitutiv erzeugt und spielen eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung. Ein Ungleichgewicht zwischen der ROS-Erzeugung und der zellulären antioxidativen Abwehr führt zu oxidativem Stress und trägt zur Entstehung von Zivilisationskrankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, bei1. Daher spielt das Gleichgewicht zwischen der Bildung von ROS und ihrer Eliminierung durch Abfangsysteme eine Schlüsselrolle in der Zellphysiologie. Bei diesem Ansatz haben sowohl natürliche als auch synthetische Antioxidantien aufgrund ihrer nachgewiesenen gesundheitsfördernden Wirkung aus pharmazeutischer und lebensmittelchemischer Sicht große Aufmerksamkeit erhalten2,3,4,5.

Koffein (1,3,7-Trimethylxanthin) ist eines der wichtigsten Purinalkaloide mit interessanten pharmakologischen Eigenschaften, einschließlich antioxidativer Wirkung6,7,8. León-Carmona und Galano schlugen fünf Mechanismen der Koffeinreaktion mit ROS vor, nämlich Radikaladduktbildung (RAF), Wasserstoffatomtransfer (HAT), Einzelelektronentransfer (SET), sequentiellen Elektronen-Protonen-Transfer (SEPT) und protonengekoppelten Elektronentransfer (PCET)9. Schließlich wurde RAF als Hauptmechanismus identifiziert, der an der direkten Fängerwirkung von Koffein beteiligt ist; Allerdings können die Art der ROS sowie die Polarität der Umgebung den Mechanismus verändern. Es sollte erwähnt werden, dass Koffein ein guter Fänger des hochreaktiven Hydroxylradikals (·OH)10 ist.

Das Hydroxylradikal ist das am stärksten oxidierende Mittel, das die meisten organischen Moleküle angreift und wird aufgrund seiner Bedeutung in biologischen und umweltbedingten Prozessen intensiv untersucht11. Das ·OH-Radikal entsteht durch die Fenton-Reaktion zwischen Eisenionen und Wasserstoffperoxid (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ·OH + OH−), sodass das Verhältnis von Wasserstoffperoxid zu Fe2+ die Bildung von ·OH beeinflusst. Andererseits ist Eisen bei vielen Stoffwechselprozessen sehr wichtig und für die Synthese von Hämoglobin (Hb) während der Erythropoese unerlässlich. Hb ist der Hauptproteinbestandteil der roten Blutkörperchen (RBC) und für die Sauerstoffbindung und -übertragung unerlässlich, während ein gestörter Eisenstoffwechsel verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, verursacht12,13. Daher wurde die Eisenchelatbildung bereits als neue Strategie zur Krebsbehandlung vorgeschlagen und zu diesem Zweck wurden mehrere Eisenchelatbildner entwickelt14,15,16,17. Koffein ist ein schwacher Eisenchelatbildner18, wir haben jedoch bereits zuvor neuartige Di- und Polyamin-Koffeinanaloga mit deutlich höherer Chelatisierungsaktivität für Eisenionen als Koffein beschrieben19.

Erythrozyten sind der Hauptzellbestandteil des menschlichen Blutes und während ihrer Lebensdauer (ca. 120 Tage) im Kreislaufsystem sowohl endogenen als auch exogenen Verbindungen, einschließlich ROS20, besonders ausgesetzt. Aufgrund des Vorhandenseins von Hb und eines hohen Anteils an mehrfach ungesättigten Lipiden in der Zellmembran sind die schädlichen Auswirkungen von ROS bei Erythrozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen am stärksten ausgeprägt. Daher wurde die Auswirkung von oxidativem Stress auf die Verkürzung der Erythrozyten-Lebensdauer durch ROS-abhängige Eryptose beschrieben und Antioxidantien als antieryptotische und antianämische Mittel gegen viele systemische Erkrankungen identifiziert21. Enzymatische Antioxidantien wie Katalase, Superoxiddismutase und Glutathionperoxid minimieren die schädlichen Auswirkungen von ROS, aber die Fähigkeit von Erythrozyten, ROS zu neutralisieren, ist begrenzt. Daher nutzen Erythrozyten Moleküle mit antioxidativen Eigenschaften, um ihr Überleben unter oxidativem Stress zu verbessern22,23. Es wurde bestätigt, dass Antioxidantien aus der Nahrung, die in die Zellmembran eingebaut werden können, Hb vor der Oxidation zu Methämoglobin (MetHb) schützen können24. Dies ist aus physiologischer Sicht sehr wichtig, da MetHb mit der Oxidation von Eisen(II)-Eisen (Fe2+) zu Eisen(III)-Eisen (Fe3+) nicht in der Lage ist, Sauerstoff (O2) zu binden und zu Geweben zu transportieren, was zu akuter oder chronischer Hypoxie führen kann. Hypoxie spielt eine Rolle bei der Pathogenese der wichtigsten Todesursachen, darunter Krebs, Stoffwechselerkrankungen, chronische Herz- und Nierenerkrankungen und Myokardischämie25. Die Auswirkungen einer langfristigen Hypoxie auf die Eigenschaften der Erythrozytenmembran und die Blutviskosität wurden ebenfalls beschrieben26. Darüber hinaus wurde kürzlich über deutlich erhöhte MetHb-Spiegel im Blut schwer erkrankter COVID-19-Patienten berichtet27. Es wurde auch vermutet, dass Koffein sowohl direkt als auch indirekt gesundheitliche Vorteile im Zusammenhang mit einer SARS-CoV-2-Infektion hat, indem es die Immunmodulation, die Bronchodilatation und die Hemmung der intrazellulären Virustranskription fördert28. Darüber hinaus durchdringt Koffein die Erythrozyten-Zellmembran und fängt das schädlichste Hydroxylradikal ab, wodurch die Caspase-3-Aktivierung und die MetHb-Bildung verhindert werden29. Die Bildung von Koffein-Hb-Komplexen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert werden, wurde durch In-vitro-30- und In-silico-29-Studien bestätigt. Interessanterweise hemmt der Koffeinmetabolit 1-Methylursäure die durch Nitrit induzierte Hb-Oxidation besser als Koffein31. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Koffein, seine Metaboliten und Derivate daher interessante Antioxidantien mit Schutzwirkung gegen die Hb-Oxidation sind, die verschiedene biomedizinische Anwendungen finden können. Darüber hinaus stellen Erythrozyten, denen Kerne und andere Organellen fehlen, ein geeignetes Modell für die In-vitro-Bewertung der Wechselwirkung natürlicher und synthetischer Verbindungen mit der Zellmembran bzw. Hb dar32,33,34.

Das Ziel dieser Studie war die Synthese neuer C8-substituierter Koffeinderivate und die Bewertung ihrer Wirksamkeit als Eisenchelatbildner und zytoprotektive Mittel unter oxidativem Stress, der durch Peroxylradikale induziert wird, die aus 2,2′-Azobis (2-Methylpropionamidin) Dihydrochlorid (AAPH) erzeugt werden. im menschlichen Erythrozyten. Es wurde ein Mechanismus für die zytoprotektive Wirkung der neuen Derivate in Erythrozyten unter oxidativem Stress vorgeschlagen.

In unserer vorherigen Studie19 berichteten wir, dass ausgewählte Di- und Polyamin-Koffeinderivate eine beeindruckende chelatbildende Aktivität und eine hemmende Wirkung auf die durch AAPH-abgeleitete freie Radikale induzierte Hämolyse menschlicher Erythrozyten aufweisen. In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir die Synthese einer neuen strukturell vielfältigen Gruppe von C8-substituierten Koffeinderivaten, die durch Modifizierung ausgewählter Diamin-Koffeinderivate (1–7) durch Hinzufügen von (i) Amid- oder Imidgruppen, (ii) Thiazolidinonen oder (ii) Thiazolidinonen erhalten wird Pyrrolidindithiocarbamat-Einheiten oder (iii) Alkadien-Substituenten (Abb. 1). Die erste Gruppe von Verbindungen wurde durch nukleophile N-Substitution der Koffeinderivate 1–3 mit Anhydrideinheiten (Maleinsäure, Bernsteinsäure, Phthalsäure, Essigsäure) erhalten (Abb. 1A). Die Essigsäureanhydride reagieren mit der primären Amingruppe zu Imid- und Amid-Koffeinderivaten (Verbindungen 8–16 bzw. 17–19). Die Reaktionen wurden in einer Essigsäurelösung durchgeführt. Alternativ erzeugten die Verbindungen 1–3 in Reaktion mit Chloracetylchlorid das N-substituierte Acetamid 1a–3a (Abb. 1A). Diese Acylierungsreaktion wurde in einer wässrigen Essigsäurelösung mit Natriumacetat als Katalysator durchgeführt. Die Verbindungen 1a–3a waren Zwischenprodukte bei der Synthese der zweiten Gruppe von Koffeinderivaten. Die Heterocyclisierung der Verbindungen 1a–3a in Gegenwart von Ammoniumthiocyanat in refluxierendem Ethanol führte zu den 4-Thiazolidinonen 20–22. Die Verbindungen 20–22 wurden durch intramolekulare Cyclisierung und Dimroth-ähnliche Umlagerungen gebildet35. Die N-Substitutionsreaktion der Verbindungen 1a–3a durch Natriumpyrrolidindithiocarbamat in refluxierendem Ethanol führte zu den Verbindungen 23–25 (Abb. 1A). Die dritte Gruppe von Verbindungen wurde durch eine Ringöffnungsreaktion von Thiophenderivaten erhalten (Abb. 1B).

Synthese der Koffeinderivate 2–25 (A) und 26–30 (B).

Es ist bekannt, dass Nitrothiophene eine Ringöffnungsreaktion mit sekundären Aminen eingehen, die zu potenziell pharmakologisch aktiven Verbindungen führt36,37. Die Koffeinanaloga 4–7 mit terminaler sekundärer Amingruppe ergaben in Reaktion mit asymmetrischem Methyl-4-nitrothiophen-2-carboxylat die Mercaptane 26–29. Die Reaktion wurde in Gegenwart von AgNO3 in absolutem Ethanol durchgeführt. Die Reaktion zwischen Verbindung 4 und symmetrischem 3,4-Dinitrothiophen (3,4-DNT) in absolutem Ethanol bei Raumtemperatur erzeugte wiederum 1,4-disubstituierte 2,3-Dinitro-1,3-butadien-Analoga 30. Methyl 4 -Nitrothiophen-2-carboxylat ist im Handel erhältlich und 3,4-Dinitrothiophen wurde durch eine dreistufige Reaktion gemäß38 erhalten. Zunächst wurde 2,5-Dibromthiophen zu 2,5-Dibrom-3,4-dinitrothiophen nitriert. Als nächstes wurden das substituierte Thiophen und die Iodwasserstoffsäure bei Raumtemperatur in Aceton gemischt, um 2-Brom-3,4-dinitrothiophen zu ergeben, das mit Kupfer in kochender Essigsäure reagierte, um 3,4-Dinitrothiophen zu ergeben.

Die chemischen Strukturen der Endprodukte 8–30 wurden anhand von Spektraldatenanalysen zugeordnet (Daten im Supplementary verfügbar).

Die metallchelatbildende Aktivität von Antioxidantien ist wichtig, da sie eine erhöhte Eisenkonzentration reduzieren kann, die an der Peroxidation zellulärer Komponenten beteiligt ist. Darüber hinaus ist die Metallchelatisierung ein medizinisches Verfahren zur Verringerung der Toxizität von Metallen durch Bindung und Ausscheidung aus dem Körper mit wirksamen Chelatbildnern14,15,16,17. Es wurde gezeigt, dass Verbindungen mit zwei oder mehr funktionellen Gruppen –OH, –COOH, –SH, –OCH3, –C=O, –PO3H2, –NR2, –O– und –S– in der entsprechenden Konfiguration binden können Eisenionen39. Über seine Sauerstoff- und Stickstoffatome kann es zu Wechselwirkungen des Koffeins mit Metallionen kommen. Aufgrund der Anwesenheit von Methylgruppen an den Atomen N1, N3 und N7 bildet Koffein jedoch über seine O2- und O6-Atome Komplexe mit Metallionen18 und seine Chelatisierungsaktivität ist gering, nämlich 6 %18 bzw. 11 %19 im Vergleich zu EDTA (100 %), verwendet als Referenzchelatbildner für Eisenionen (Fe2+). In dieser Studie wurde ein kolorimetrischer Assay auf Ferrozinbasis angewendet, um zu untersuchen, ob eine strukturelle Modifikation von C8-Diaminoalkylkoffeinderivaten deren Chelatisierungsaktivität erhöht. Wie in Abb. 2A gezeigt, chelatisieren alle neuen Koffeinderivate Fe2+ auf strukturabhängige Weise, und einige von ihnen weisen hohe Chelatisierungseffizienzen auf, die jeweils zwischen 54 und 113 % der EDTA-Aktivität liegen.

(A) Die eisenhaltige chelatbildende Aktivität von Koffeinderivaten bei 0,1 mg/ml, dargestellt als %-Aktivität des Standard-Chelators EDTA. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (B) In-vitro-Schutzaktivität von Koffeinderivaten und dem Standard-Antioxidans Trolox (Tx) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml gegen AAPH-induzierte oxidative Hämolyse. Erythrozyten wurden mit Verbindungen vorinkubiert (20 Min.) und mit 60 mM AAPH inkubiert (240 Min.). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung im Vergleich zur Tx-Aktivität dargestellt (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). Der statistisch nicht signifikante Unterschied wird als ns angegeben.

Für die Imid- und Amidderivate von Koffein (Abb. 1, Pfad a) wurde die höchste Chelatisierungsaktivität für die Derivate 9, 10, 15 und 19 gefunden (von 89 bis 113 % der EDTA-Aktivität), was von (i) abhängt. die Art des verwendeten Anhydrids und (ii) die Länge der Alkylkette. Die chelatbildenden Eigenschaften dieser Derivate können auf das Vorhandensein von Carbonylgruppen zurückgeführt werden, die mit einer cis-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung (9, 10, 15) oder einer Amidgruppe (19) konjugiert sind. Die O-, C- und N-Atome der genannten Derivate können konjugierte Systeme bilden – zwei tautomere (Keto-Enol)-Strukturen für 9, 10 und 15 und zwei Resonanzstrukturen für Verbindung 19. Darüber hinaus kann die Chelataktivität mit der Länge erhöht werden der Alkyldiaminkette.

Thiazolidinon kann mit Stickstoff und Sauerstoff als Donoratome Metallkomplexe bilden40. Die chelatbildenden Eigenschaften von Derivaten mit einer Thiazolidinongruppe (Verbindungen 20–22) sind unterschiedlich (57, 54 bzw. 12 %). Die niedrigste Chelatisierungsaktivität von Verbindung 22 (Alkylkette n = 4) weist darauf hin, dass zwei Stickstoffatome an der Metallkoordination beteiligt sind, eines vom Thiazolidinonmolekül und eines vom N-Alkyl-Linker. Die Chelatisierungseffizienz der Derivate mit einer Pyrrolidindithiocarbamat-Einheit (Verbindungen 23–25) liegt zwischen 9 und 12 % und ähnelt der Chelatisierungseffizienz von Koffein (11 %, siehe 19). In diesem Fall ist die geringe Chelatisierungsaktivität wahrscheinlich auf die ungünstige Anordnung der Xanthinringe und der eingeführten Einheit zurückzuführen. Es gab keine Unterschiede in der Fe2+-Chelatisierungsaktivität zwischen den Derivaten 26–30 (von 71 bis 87 %) und den Ausgangsverbindungen 4–7 (siehe 19). Die zusätzliche strukturelle Modifikation der Ausgangsverbindungsmoleküle, insbesondere im Fall der Verbindung 30, die aus zwei Koffeinmolekülen besteht, erhöht ihre Eisenchelatisierungsaktivität nicht.

Carelli-Alinovi et al. zeigten, dass Koffein die RBC-Membran, einschließlich der Phospholipid-Asymmetrie und der Band-3-Proteinfunktion, wirksam vor durch Amyloid-Beta-Peptid (1–42) induzierter oxidativer Veränderung schützt41. Diese hervorragende Studie stützt die Hypothese einer schützenden Rolle von Koffein bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und anderen neurodegenerativen Pathologien, die mit oxidativem Stress verbunden sind. Koffein befindet sich vorzugsweise im hydrophoben Bereich der Lipiddoppelschicht der Zellmembran, kann sich jedoch nicht spontan aus der wässrigen Umgebung ausscheiden42. Andererseits wurde die sehr hohe Bioverfügbarkeit von Koffein durch In-vivo-Studien ermittelt43, sodass Koffein ein wichtiges Modellmolekül in der pharmazeutischen Wissenschaft ist. Um die zytoprotektive Aktivität der neuen Koffeinderivate zu untersuchen, wurde ihre membranschädigende Aktivität zunächst in einem Hämolysetest mit menschlichen Erythrozyten untersucht. Es ist zu beachten, dass die hämolytische Aktivität von Verbindungen über 5 % sie bei einer bestimmten Konzentration von einer weiteren Bewertung ausschließt19,32,44. Bei allen Derivaten, die in einer Konzentration von 0,1 mg/ml verwendet wurden, wurde keine hämolytische Aktivität von mehr als 5 % beobachtet, und zwar lag der Bereich ihrer hämolytischen Aktivität zwischen 1,48 % ± 2,35 und 3,07 % ± 1,82. Darüber hinaus gab es keine modifizierende Wirkung der Derivate auf die Form der Erythrozyten. Die erhaltenen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die strukturelle Modifikation der Ausgangsmoleküle (siehe Abb. 1) zu nicht zytotoxischen, biokompatiblen (hämokompatiblen) Verbindungen führte, deren zytoprotektive Aktivität weiter bewertet werden kann.

Die zytoprotektiven Eigenschaften aller Derivate gegen oxidative Schäden in Erythrozyten, die durch Peroxylradikale (ROO·) hervorgerufen werden, die durch die thermische Zersetzung des hydrophilen 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidin)dihydrochlorids (AAPH) entstehen, wurden bei einer Konzentration von 0,1 mg bewertet /ml. Diese gewählte Konzentration wurde zuvor zur Beurteilung der Eigenschaften von Di- und Polyamin-Analoga von Koffein19 und Gramin-Derivaten44 verwendet. Die zytoprotektive Aktivität der Derivate wurde mit der von Trolox verglichen, das als Referenzantioxidans verwendet wurde. Wie in Abb. 2B gezeigt, schützen die Derivate Erythrozyten auf strukturabhängige Weise vor Peroxylradikalen (ROO·)-induzierter oxidativer Hämolyse. Von den 33 getesteten Verbindungen zeigten 13 eine zytoprotektive Aktivität, die mehr als 50 % der Aktivität von Trolox betrug. Darüber hinaus gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der zytoprotektiven Aktivität der Derivate 18 und 30 und Trolox. Andererseits war die Aktivität der Derivate 8, 20, 23, 24–25 ähnlich der für Koffein erhaltenen und betrug 12 % (siehe 19).

Es wurde beschrieben, dass Koffein verschiedene ROS in einstufigen bzw. mehrstufigen Reaktionen neutralisiert9. Mechanismen, die eine einstufige Reaktion beinhalten, sind RAF (Radikaladduktbildung), SET (Einzelelektronentransfer) und HAT (Wasserstoffatomtransfer). Im Gegensatz dazu sind PCET (Proton Coupled Electron Transfer) und SEPT (Sequential Electron Proton Transfer) mehrstufige Mechanismen. Devasagayam et al. zeigten, dass Koffein die Membranlipidperoxidation hemmt, die durch verschiedene ROS in der folgenden Reihenfolge induziert wird: Hydroxylradikal (·OH), Singulettsauerstoff (1O2) bzw. Peroxylradikal (ROO·)7. Darüber hinaus wurde eine ·OH-Fängeraktivität von Koffein über einen SET-Mechanismus vorgeschlagen45.

In unserer Studie fangen neu synthetisierte Koffeinderivate aus AAPH erzeugte Peroxylradikale effektiv ab und schützen Erythrozyten aufgrund des Vorhandenseins von Substituenten an der C-8-Position, was durch HAT-, SET- oder RAF-Mechanismen erklärt werden kann. Galano et al. zeigten, dass die Anwesenheit von elektronenschiebenden Gruppen wie –NH–COCH3 die Effizienz des SET-Mechanismus verringert, während die Anwesenheit von elektronenziehenden Gruppen wie NO2 sie erhöht. Der RAF-Mechanismus wird als Antioxidans mit Mehrfachbindungen charakterisiert46. Die Derivate 17–19 mit einer NH-Amidgruppe sind die effizientesten wasserstoffatomspendenden Verbindungen, die mithilfe des HAT-Mechanismus effizient mit Peroxylradikalen reagieren können. Die Aktivität der Verbindungen 26–30 beruht wahrscheinlich auf elektronenreichen ungesättigten Bindungen, die es ihnen ermöglichen, als Elektronendonoren für die Bildung eines Radikals oder die Addition eines Peroxylradikals zu reagieren. Darüber hinaus begünstigt das Vorhandensein ungesättigter konjugierter Bindungen die Dislokation des Radikals. Aufgrund der Anwesenheit ungesättigter Bindungen können die Derivate 26–30 das Peroxylradikal mithilfe des RAF-Mechanismus erfolgreich neutralisieren. Darüber hinaus kann im Fall der Derivate 26–29 aufgrund der Anwesenheit elektronenziehender Gruppen der RAF-Mechanismus mit dem SET-Mechanismus konkurrieren. Darüber hinaus ähneln die Verbindungen 17–19 und 26–29 strukturell Vitamin E (Tocopherol), einem bekannten natürlichen Antioxidans. Diese Derivate und Vitamin E haben ein bizyklisches System mit einer externen verzweigten Alkylkette. Die „polarer Kopf-nichtpolarer Schwanz“-Struktur des Moleküls erleichtert seine Wechselwirkung mit der Lipiddoppelschicht der Erythrozytenmembran. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Wechselwirkung des „Polarkopf-nichtpolarer Schwanz“-Moleküls mit der Lipiddoppelschicht die Stabilität der Erythrozytenmembran erhöhen und folglich den Erythrozytenschutz gegen ROS44 verbessern kann. Daher kann die höchste zytoprotektive Aktivität der Verbindung 18 (strukturell ähnlich wie Vitamin E) durch ihre Wechselwirkung mit der Zellmembran aufgrund (i) der geeigneten Alkylkettenlänge bzw. durch (ii) ihre direkte ROS-Fängeraktivität erklärt werden. Die elektronenspendende Fähigkeit der Verbindung 30 wird wahrscheinlich durch die Anwesenheit von zwei durch eine Alkylkette verbundenen Koffeinmolekülen gestützt (siehe Abb. 1).

Ausgewählte Derivate mit der höchsten zytoprotektiven Aktivität (9, 18, 26, 27, 29, 30) wurden verwendet, um ihre Auswirkungen auf AAPH-induzierten oxidativen Stress in Erythrozyten in einem zellulären Antioxidans-Assay (CAA) zu untersuchen47,48. In diesem Assay wird die membrandurchlässige hydrophobe fluoreszierende Redoxsonde 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCF-DA) durch zelluläre Esterasen deacetyliert und im Erythrozyten eingeschlossen. DCF durchläuft dann eine ROS-abhängige Oxidation, die zu seiner Umwandlung in eine fluoreszierende Form führt, deren Fluoreszenzintensität von den ROS-Werten abhängt. Abbildung 3 zeigt Histogramme und stellt die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte (MFI) dar, die mit dem Durchflusszytometer für die untersuchten Proben ermittelt wurden. Wie erwartet wurde der niedrigste ROS-Gehalt in in PBS-Puffer inkubierten Kontroll-Erythrozyten (Abb. 3A, E) und der höchste in mit AAPH inkubierten Erythrozyten (Abb. 3D, E) festgestellt. Wie in Abb. 3E gezeigt, reduzierten alle ausgewählten Derivate strukturabhängig die ROS-Spiegel in Erythrozyten, aber das Standardantioxidans Trolox war am wirksamsten (vergleiche auch Abb. 3B mit C). Basierend auf den Ergebnissen kann gefolgert werden, dass alle ausgewählten Derivate die RBC-Membran passieren und ROS innerhalb der RBC auf strukturabhängige Weise abfangen.

Hemmende Aktivität ausgewählter Koffeinderivate auf ROS-Ebene, erzeugt durch 60 mM AAPH (1,5 h, 37 °C) in menschlichen Erythrozyten, geschätzt als mittlere DCF-Fluoreszenzintensität (MFI). Die repräsentativen Durchflusszytometrie-Histogramme werden dargestellt: (A) PBS, negative Kontrolle, (B) Derivat 27 + AAPH, (C) Trolox, referenziertes Antioxidans, + AAPH, (D) AAPH, positive Kontrolle, (E) mittlere Fluoreszenzintensität ( MFI-Werte (± SD, n = 6) von DCF in Erythrozyten, erhalten für getestete Probenderivatproben.

Die supravitale konfokale Analyse der Erythrozyten wurde gleichzeitig mit Durchflusszytometriemessungen durchgeführt. Wie erwartet nahm die Fluoreszenzintensität von DCF-beladenen Erythrozyten in Gegenwart des Derivats 18 (Abb. 4C) und des Standardantioxidans Trolox (Abb. 4D) im Vergleich zur AAPH-Probe (Abb. 4B) signifikant ab. Die Form der Erythrozyten war überwiegend diskozytisch (Abb. 4A–C); Allerdings wurden Echinozyten in Gegenwart von Trolox beobachtet (Abb. 4D). Hierbei ist zu beachten, dass Erythrozyten die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper sind, um die Blutflusseigenschaften im Kreislaufsystem zu optimieren, und dass die Stomatozyten-Diskozyten-Echinozyten-Transformation (SDE) der Erythrozytenform sowohl in vivo als auch in vivo ein gut beschriebenes Phänomen ist in vitro50. Daher sind die in dieser In-vitro-Studie beobachteten diskozytischen und echinozytären Formen menschlicher Erythrozyten physiologisch.

Supravitale Visualisierung des ROS-Spiegels durch die fluoreszierende Redoxsonde DCF-DA (10 µM, 30 min, 37 °C) in der konfokalen Mikroskopie: (A) Kontroll-RBC (PBS), (B) 60 mM AAPH (2 h), (C) Derivat 18 (0,1 mg/ml, 20 min Vorinkubation) + 60 mM AAPH (1,5 h), (D) Trolox (0,1 mg/ml, 20 min Vorinkubation) + 60 mM AAPH (1,5 h). Das obere Feld – Fluoreszenzbilder, das mittlere Feld – Durchlichtbilder, das untere Feld – verschmelzen Fluoreszenz- und Durchlichtbilder. Präsentiert werden die repräsentativen Bilder einer Versuchsreihe. Maßstabsbalken = 10 µm.

Hämoglobin (Hb) ist das Hauptprotein in Erythrozyten, das die Funktion des Sauerstofftransports übernimmt. Unter physiologischen Bedingungen entstehen durch die Autooxidation von Hb kontinuierlich kleine Mengen Methämoglobin (MetHb), wobei Hämeisen zu Eisen(III) oxidiert wird51. MetHb wird durch Nicotinamidadenindinukleotid (NADH)-abhängige Cytochrom-b5-Reduktase zurück in Hb umgewandelt. Wenn jedoch die ROS-Werte erhöht sind, ist das Antioxidationssystem wirkungslos und der Sauerstofftransport zum Gewebe wird beeinträchtigt, was zu Ischämie führt. Um die Schutzwirkung selektiver Derivate gegen die Hb-Oxidation zu untersuchen, wurden Spektralscans von Hb (450–700 nm) durchgeführt. In der Kontrollprobe (PBS-Puffer) ist Oxyhämoglobin durch zwei Peaks bei 540 und 570 nm gekennzeichnet (Abb. 5, rote Linie), und MetHb, das einen Peak bei 630 nm ergibt, fehlt. In der Probe mit AAPH nimmt der Oxy-Hb-Peak ab und es erscheint ein für MetHb spezifischer Peak (Abb. 5, grüne Linie). In Gegenwart des Derivats 27 gibt es keine Veränderung der Oxy-Hb-Peaks im Vergleich zur AAPH-Probe, aber der MethHb-Peak nahm ab (Abb. 5, blaue Linie) von einem Absorptionswert von 0,052 auf 0,033 (siehe Tabelle in Abb. 5). Zusammenfassend schützte Derivat 27 Hb vor der MetHb-Bildung (Abb. 5).

Spektralscans (450–700 nm) von Hämoglobin (Hb) in Überständen nach 4-stündiger Inkubation von Erythrozyten in PBS (rote Linie), 60 mM AAPH (grüne Linie), Derivat 27 (0,1 mg/ml) und 60 mM AAPH ( blaue Linie). Für jeden Scan werden die bei 540, 578 (Oxy-Hb-Peaks) und 630 nm (MetHb-Peaks) gemessenen Absorptionswerte (Ab) angezeigt. Die repräsentativen Daten für eine Reihe von Experimenten werden präsentiert.

Heinz-Körper sind Erythrozyteneinschlüsse von Hemichrom, die aus oxidiertem oder denaturiertem Hb gebildet werden, am häufigsten in alten Erythrozyten oder bei bestimmten Erkrankungen, einschließlich Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PD)-Mangel und instabilen Hb-Erkrankungen52. Antioxidantien mit der Fähigkeit, die Zellmembran zu passieren, wie etwa die natürliche Phenolverbindung Allylpyrocatechin, können die Bildung von Heinz-Körpern in Erythrozyten, die mit von AAPH abgeleiteten freien Radikalen inkubiert wurden, deutlich reduzieren53. Eine lichtmikroskopische Analyse zeigte, dass ausgewählte Derivate, nämlich Derivat 27, die Bildung von Heinz-Körpern unter AAPH-induziertem oxidativem Stress reduzierten (Abb. 6). Die Hemmung der Hb-Oxidation durch Derivat 27 bestätigt seine hohe hämoprotektive Wirksamkeit.

Supravitale Visualisierung von Heinz-Körpern in Erythrozyten, gefärbt mit Methylviolett (0,5 %, 45 Min., 37 °C) im Lichtmikroskop: (A) Kontroll-Erythrozyten (PBS), (B) 60 mM AAPH (4 Stunden); (C) Derivat 27 (0,1 mg/ml, 20 min Vorinkubation) + 60 mM AAPH (4 h); (D) Trolox (0,1 mg/ml, 20 min Vorinkubation) + 60 mM AAPH (4 h). Einfügungen in (B) und (C) Vergrößerung von Erythrozyten mit Heinz-Körperchen, die als kleine, gefärbte Körnchen neben der Erythrozytenmembran sichtbar sind. Die repräsentativen Bilder für eine Reihe von Experimenten werden präsentiert. Maßstabsbalken = 10 µm.

Zusammenfassend zeigten unsere mit verschiedenen Tests erzielten Ergebnisse, dass ausgewählte C-8-substituierte Koffeinderivate (i) wirksame Eisenionen-Chelatoren sind, (ii) biokompatible und zellmembrangängige Verbindungen, die (iii) die Erythrozytenmembran und das Hämoglobin wirksam schützen ROS-induzierter Schaden.

In-silico-Methoden sind eines der effektivsten Instrumente zur Überprüfung des Potenzials einer Verbindung als Arzneimittel und bieten die Möglichkeit, das ADME-Profil (Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung) vorherzusagen. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften aller untersuchten Verbindungen wurden mithilfe des SwissADME-Webservers berechnet.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, sind alle neu gewonnenen Verbindungen lipophiler als Koffein. Die meisten der neuen Koffeinderivate mit log P-Werten zwischen 1 und 3 weisen eine gute Lipophilie auf, die es ihnen ermöglicht, die Lipiddoppelschicht der Zellmembran zu passieren. Die höchsten log P-Werte werden in Verbindungen beobachtet, die einen ungesättigten Alkylsubstituenten an C-8 der Xanthineinheit enthalten (Verbindungen 26–29); Im Allgemeinen ist der Verteilungskoeffizient umso höher, je länger die Alkylseitenkette ist. Verbindung 29 ist die lipophilste (log P 4,36) aller getesteten Verbindungen. Darüber hinaus erfüllen die meisten Verbindungen die Kriterien der „5-Regel“ (weniger als 5 HB-Donoren, 10 HB-Akzeptoren, Molekulargewicht < 500 und berechneter log P < 554), was sie zu vielversprechenden Antioxidantien macht. Wie bereits erwähnt, lokalisiert sich das Koffeinmolekül bevorzugt im hydrophoben Teil der Zellmembran42. Daher kann Derivat 30 mit zwei Koffeinmolekülen effizienter mit dem hydrophoben Teil der Lipiddoppelschicht interagieren und dadurch die molekulare Membranstruktur gegen Schäden durch freie Radikale stabilisieren. Darüber hinaus können die Verbindungen 26–30 als Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren über Wasserstoffbrücken effektiv mit den Zellmembrankomponenten interagieren und ROS-RBC-Membranwechselwirkungen verhindern oder verzögern. Trotz der bekannten Tatsache, dass Koffein das am häufigsten konsumierte Stimulans des Zentralnervensystems ist55, können seine ausgewählten C8-substituierten Derivate als wirksame Antioxidantien und zytoprotektive Mittel bei der Vorbeugung oder Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wirken.

Koffein ist eine der bekanntesten und am häufigsten konsumierten psychoaktiven Verbindungen. Der tägliche Konsum von Koffein kann Teil einer Diät sein, die vor kognitivem Verfall und Demenz schützt, die mit zunehmendem Alter fortschreitet. Ziel unserer Studie war es daher, den Einfluss struktureller Veränderungen von Koffein auf seine antioxidative und zytoprotektive Wirksamkeit in menschlichen Erythrozyten als Modellzellen zu untersuchen.

Unsere Ergebnisse zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Struktur biokompatibler C8-substituierter Koffeinderivate und ihrer Fähigkeit, (i) Eisenionen zu komplexieren und (ii) menschliche Erythrozyten vor den schädlichen Auswirkungen von oxidativem Stress zu schützen. Die höchste Chelatisierungsaktivität der Verbindungen 9, 10, 15 und 19 kann auf das Vorhandensein tautomerer oder Resonanzstrukturen mit einer -OH-Gruppe zurückgeführt werden, die ihnen die Bildung von Komplexen mit Eisenionen ermöglicht. Zur Erklärung des antioxidativen Potenzials der Derivate wurde ein Mechanismus aus SET, RAF und/oder HAT und Radikalstabilisierung vorgeschlagen. Die Derivate 17–19 mit NH-Amidgruppe und 26–30 mit ungesättigten konjugierten Bindungen, die die Radikalverlagerung fördern, zeigten eine hohe Schutzaktivität in menschlichen Erythrozyten. Die Derivate 17–19 neutralisieren das Peroxylradikal über den HAT-Mechanismus, während die Derivate 26–30 über den RAF-Mechanismus neutralisieren. Darüber hinaus kann im Fall der Derivate 26–29 der RAF-Mechanismus mit dem SET-Mechanismus konkurrieren. Darüber hinaus könnte die hohe zytoprotektive Aktivität der Derivate 18 und 30 mit ihrer spezifischen amphiphilen Struktur zusammenhängen, die es ihnen ermöglicht, über Wasserstoffbrückenbindungen mit der hydrophoben bzw. hydrophilen Region der Zellmembran zu interagieren. Die Wechselwirkung der Derivate mit der Zellmembran führt zu deren Stabilisierung, wodurch sowohl Membrankomponenten als auch Hämoglobin vor ROS-induzierter Oxidation geschützt werden.

Zusammenfassend deuten unsere sowohl in vitro als auch in silico erzielten Ergebnisse darauf hin, dass die Eisenchelatbildung und die spezifische Wechselwirkung mit der menschlichen Erythrozytenmembran für die beeindruckenden zytoprotektiven Eigenschaften ausgewählter C-8-substituierter Koffeinderivate verantwortlich sind. Da die meisten der neu gewonnenen biokompatiblen Koffeinderivate die Kriterien der Fünferregel von Lipinski erfüllen, können sie für weitere Strukturmodifikationen verwendet werden, um unser Wissen über die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von zytoprotektiven Verbindungen auf Koffeinbasis mit vorteilhaften pharmakologischen Eigenschaften zu erweitern.

Alle Ausgangsmaterialien wurden von Sigma-Aldrich bezogen und ohne Reinigung verwendet. Protonen- (1H) und Kohlenstoff-NMR-Spektren (13C) wurden mit einem Varian Gemini 300/400-Spektrometer bei 300 und 75 MHz mit DMSO-d6 als Lösungsmittel und TMS als internem Standard aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen werden in δ (parts per million) angegeben. FTIR-Spektren wurden mit einem Nicolet iS5-Spektrometer (KBr-Pellets) aufgezeichnet. EI-Massenspektren wurden mit einem 320-MS/450-GC-Massenspektrometer (Bruker) gemessen. Die Schmelzpunkte wurden mit einem SMP-20-Gerät (BŰCHI Labortechnik AG) bestimmt. Die analytische Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Kieselgelplatten 60 F254 (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Der Nachweis auf der DC erfolgte durch UV-Licht.

Die Synthese der Verbindungen 1–7 wurde in unserem vorherigen Artikel19 beschrieben.

Eine Mischung aus den richtigen 8-Diaminocoffein-Derivaten 1–3 (1 mmol) und dem entsprechenden Anhydrid (1 mmol) in Essigsäure (10 ml) wurde 1–15 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die erhaltene Mischung wurde mit CH2Cl2 extrahiert und über MgSO4 getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft, dann wurde das Rohprodukt 8–19 aus CHCl3 umkristallisiert.

Zu einer Lösung geeigneter Diaminocoffein-Analoga 1–3 (1 mmol) in Essigsäure (97 % wässrige Lösung; 10 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus 2-Chloracetylchlorid (97 % wässrige Lösung, 0,08 ml, 1 mmol) gegeben. . Als die Reaktionsmischung eine Temperatur von 40 °C erreichte, wurde Natriumacetat (320 mg, 1 mmol) in destilliertem Wasser (8 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 8 Stunden lang bei einer Temperatur von 40–60 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit CHCl3 (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft, um ein Öl zu ergeben.

Eine Mischung aus geeigneten Koffeinderivaten (1a, 2a oder 3a) (1 mmol) und Ammoniumthiocyanat (76,12 mg, 1 mmol für 1a; 152,24 mg, 2 mmol für 2a und 3a) in Ethanol (10 ml) wurde unter Rückfluss erhitzt für 22–43 Stunden und bei Abkühlung auf Raumtemperatur. Die Lösung wurde eingedampft, um ein Öl zu ergeben.

Eine Mischung aus geeigneten Koffeinderivaten (1a, 2a oder 3a) (1 mmol) und Natriumpyrrolidindithiocarbamat (338,48 mg, 2 mmol) in Ethanol (10 ml) wurde 33–40 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt . Die Lösung wurde eingedampft, um ein Öl zu ergeben.

Eine Suspension von Methyl-4-nitrothiophen-2-carboxylat (1 mmol; 187 mg) in wasserfreiem Ethanol (5 ml) wurde unter magnetischem Rühren auf 40 °C erhitzt und Silbernitrat (1 mmol; 170 mg) zugegeben. Nach 15 Minuten wurden die entsprechenden Koffeindiamin-Derivate 4–7 (1 mmol) zugegeben, die Reaktionsmischung 20 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und drei Tage lang unter magnetischem Rühren gehalten. Anschließend wurde es auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Wasser (10 ml) verdünnt. Die Wasserphase wurde mit CH2Cl2 (3 × 30 ml) extrahiert und über MgSO4 getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um ein Rohprodukt zu ergeben, das aus Petrolether kristallisiert wurde.

Eine Suspension von 3,4-Dinitrothiophen (1 mmol; 174 mg) in wasserfreiem Ethanol (5 ml) wurde unter magnetischem Rühren auf 40 °C erhitzt. Nach 15 Minuten wurde 8-(Methyl(2-(methylamino)ethyl)amino)koffein (2 mmol; 568 mg) zugegeben, die Reaktionsmischung wurde 20 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt und 3 Tage lang unter magnetischem Rühren gehalten. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Wasser (10 ml) verdünnt. Die Wasserphase wurde mit CH2Cl2 (3 × 30 ml) extrahiert und über MgSO4 getrocknet. Das organische Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, um einen Rückstand zu ergeben, und das Rohprodukt wurde aus Petrolether kristallisiert.

Die Chelatisierungsaktivität von Eisenionen (Fe2+) wurde durch Hemmung der Bildung des Fe2+-Ferrozin-Komplexes nach Inkubation der getesteten Verbindungen mit Fe2+ bewertet. Die Fe2+-Chelatisierungsfähigkeit der getesteten Verbindungen wurde durch die Absorption des Eisenionen-Ferrozin-Komplexes bei 562 nm bei Raumtemperatur (~ 22 °C, RT) bestimmt. Kurz gesagt wurde eine Konzentration von 0,1 mg/ml der getesteten Verbindungen in 0,2 ml Ethylalkohol zu einer Lösung von 0,6 mM FeCl2 (0,05 ml) gegeben. Als Standard-Metallchelatbildner wurde EDTA verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 mM Ferrozin (0,05 ml) in Ethylalkohol und sofortigem kräftigen Schütteln gestartet. Die Proben wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. Nach der Inkubation wurde die Absorption (Abs) der Lösungen bei 562 nm in einem BioMate™ 160 UV-Vis-Spektrophotometer gemessen. Der Prozentsatz der Hemmung der Bildung des Ferrozin-Fe2+-Komplexes wurde anhand der Gleichung berechnet:

Dabei ist Abs0 die Absorption der Probe ohne die getestete Verbindung und Abs1 die Absorption in Gegenwart der getesteten Verbindung. Jede Probe wurde dreifach hergestellt und es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und die Bioethikkommission genehmigte alle experimentellen Protokolle für wissenschaftliche Forschung an der Medizinischen Universität Posen (Vereinbarung Nr. ZP/907/1002/18). Konzentrate menschlicher roter Blutkörperchen wurden von der Blutbank in Posen ohne jeglichen Kontakt mit Blutspendern gekauft. Von allen Blutspendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Frische menschliche Erythrozytensuspensionen (Hämatokrit 65 %) wurden dreimal (3000 U/min, 10 Min., + 4 °C) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (PBS – 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4) gewaschen. ergänzt mit 10 mM Glucose. Nach dem Waschen wurden die Zellen in PBS-Puffer bei 1,65 × 109 Zellen/ml (Hämatokrit 15 %) suspendiert, bei 4 °C gelagert und innerhalb von 5 Stunden verwendet.

Die hämolytische Aktivität wurde wie zuvor berichtet bewertet19. Kurz gesagt, RBC (1,65 × 108 Zellen/ml, Hämatokrit 1,5 %) wurden in PBS (pH 7,4), ergänzt mit 10 mM Glucose und mit getesteten Verbindungen in einer Konzentration von 0,1 mg/ml, 60 Minuten lang bei 37 °C unter Schütteln inkubiert Inkubator. Die Konzentration der in dieser Studie verwendeten Derivate wurde gemäß unserer vorherigen Forschung ausgewählt19,44. Als Kontrollprobe wurden Proben mit in PBS inkubierten Erythrozyten ohne getestete Verbindungen entnommen. Jede Probe wurde dreimal wiederholt und die Experimente wurden viermal mit Erythrozyten verschiedener Spender wiederholt. Nach der Inkubation wurden die RBC-Suspensionen zentrifugiert (3000 U/min, 10 Min., + 4 °C) und der Grad der Hämolyse durch Messung der Absorption des Überstands bei λ = 540 nm in einem BioMate™ 160 UV-Vis-Spektrophotometer geschätzt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz (%) der Hämolyse ausgedrückt. Hämolyse 0 % wurde als Absorption des Überstands der Erythrozytensuspensionen in PBS-Puffer angenommen, während die Gesamthämolyse (100 %) bestimmt wurde, wenn PBS durch eiskaltes destilliertes Wasser ersetzt wurde. Ein Hämolysegrad < 5 % bedeutet, dass eine Verbindung keine hämolytische Aktivität aufweist.

Nach der Inkubation mit Verbindungen in einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurden die Erythrozyten eine Stunde lang bei RT in 5 % Paraformaldehyd (PFA) plus 0,01 % Glutaraldehyd (GA) fixiert. Fixierte Erythrozyten wurden durch Austausch des Überstands mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Erythrozyten auf mit Poly-L-Lysin behandelten Deckgläsern (0,1 mg/ml, 10 Min. bei RT) abgesetzt und auf 80 % Glycerin montiert. Die Deckgläser wurden mit Nagellack versiegelt. Eine große Anzahl von Zellen in mehreren separaten Versuchsproben wurde mit einem konfokalen Zeiss LSM 510 (AXIOVERT ZOOM)-Mikroskop (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Deutschland) (Immersionsölobjektiv mit 100 × / 1, 4-Apertur, 10 × Okular) untersucht. Die Bilder wurden mit dem Programm Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen.

Die zytoprotektive Aktivität der Derivate wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methode44 bewertet. Kurz gesagt, RBC (1,65 × 108 Zellen/ml, 1,5 % Hämatokrit) wurden in PBS (pH 7,4), ergänzt mit 10 mM Glucose, mit der getesteten Verbindung oder Trolox, das als Standardantioxidans verwendet wurde, in einer Konzentration von 0,1 mg/ml für 20 Minuten vorinkubiert bei 37 °C im Schüttelinkubator. Die Konzentration der Derivate wurde gemäß unseren früheren Studien ausgewählt19,44. Nach der Vorinkubation wurde 2,2′-Azobis(2-methylpropionamidin)-dihydrochlorid (AAPH) in einer Endkonzentration von 60 mM zugegeben und die Proben wurden für die nächsten vier Stunden inkubiert. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle wurden in PBS und mit AAPH inkubierte Erythrozyten herangezogen. Nach der Inkubation wurden die Erythrozytensuspensionen zentrifugiert (3000 U/min, 5 Min., + 4 °C) und der Grad der Hämolyse wurde durch Messung der Absorption (Abs) des Überstands bei λ = 540 nm in BioMate™ 160 UV–Vis bestimmt Spektrophotometer. Der Prozentsatz der ROS-induzierten Hämolysehemmung wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei ist Abscomp der Absorptionswert des Überstands, der aus Proben erhalten wurde, die mit einer in Gegenwart von AAPH getesteten Verbindung inkubiert wurden, AbsPBS ist die Absorption des Überstands, der aus der Negativkontrolle erhalten wurde, und AbsAAPH ist die Absorption des Überstands, der aus der Positivkontrolle erhalten wurde. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung hergestellt und die Ergebnisse werden als Mittelwert (± SD) aus drei unabhängigen Experimenten mit Erythrozyten verschiedener Spender dargestellt.

Der ROS-Wert wurde wie bereits berichtet festgestellt48. Kurz gesagt wurde die Redox-Fluoreszenzsonde 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCF-DA) (Sigma-Aldrich D6883) verwendet, um den ROS-Gehalt in intakten Erythrozyten abzuschätzen. Mit ausgewählten Derivaten oder Trolox (wie oben beschrieben) vorinkubierte und mit 60 mM AAPH (1,5 h, 37 °C) inkubierte Erythrozyten wurden gewaschen (3000 U/min, 5 min, + 4 °C) und dann mit DCF-DA bei a inkubiert Endkonzentration von 10 μM bei 37 °C für 30 Minuten im Dunkeln. DCFDA-beladene Erythrozyten (100 µl) wurden in 1000 µL PBS resuspendiert und sofort wurde die ROS-abhängige DCF-Fluoreszenzintensität in Erythrozyten bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm auf einem Durchflusszytometer Cytomix FC 500 gemessen MPL (Beckman Coulter). Die Ergebnisse wurden als Histogramme und Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) dargestellt.

Für die Durchflusszytometrieanalyse vorbereitete Erythrozyten (wie oben) wurden gewaschen (3000 U/min, 5 Min., + 4 °C) und auf mit Poly-L-Lysin behandelten (0,1 mg/ml, 10 Min., RT) Deckgläsern abgesetzt und darauf montiert 80 % Glycerin. Sofort wurden lebende Zellen unter Verwendung eines konfokalen Zeiss LSM 510 (AXIOVERT ZOOM)-Mikroskops (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Deutschland) (Immersionsölobjektiv mit 100 × / 1,4 Apertur, 10 × Okular) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einem analysiert Emissionswellenlänge von 530 nm. Die Bilder wurden mit dem Programm Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen.

Die Absorptionsspektren von Hämoglobin wurden im sichtbaren Bereich von 450 bis 700 nm im BioMate™ 160 UV-Vis-Spektrophotometer gescannt, wobei Überstände ausgewählter Proben verwendet wurden, die im Abschnitt „Hemmung der durch oxidativen Stress induzierten Hämolyse“ erhalten wurden. Aus ausgewählten Proben im Abschnitt „Hemmung der durch oxidativen Stress induzierten Hämolyse“ gewonnene Erythrozyten wurden zur intrazellulären Visualisierung von Heinz-Körpern verwendet. Die Zellen wurden 45 Minuten lang bei RT mit Methylviolett (0,5 % in 0,9 % NaCl) gefärbt. Nach der Inkubation wurden die Erythrozyten gewaschen und eine Stunde lang bei RT in 5 % PFA plus 0,01 % GA fixiert. Fixierte Erythrozyten wurden durch Austausch des Überstands mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Erythrozyten auf mit Poly-L-Lysin behandelten (0,1 mg/ml, 10 Min., RT) Deckgläsern abgesetzt und auf 80 % Glycerin montiert. Die Deckgläser wurden mit Nagellack versiegelt. Eine große Anzahl von Zellen in mehreren separaten Versuchsproben wurde mit einem RED-233 MOTIC-Mikroskop (63 x/1,4 Apertur, 10 x Okular) untersucht. Die Bilder wurden mit Motic Images Plus 3.0 aufgenommen.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften aller getesteten Verbindungen wurden mit dem SwissADME-Webserver www.swissadme.ch berechnet.

Für die antioxidativen und zytoprotektiven Eigenschaften wurden die Daten als Mittelwert ± SD von drei oder vier unabhängigen Experimenten mit jeder Probe in dreifacher Ausfertigung (n = 9) aufgetragen. Ein gepaarter t-Student-Test wurde verwendet, um die Aktivität der Derivate mit der Aktivität des Standardantioxidans Trolox zu vergleichen. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied als ns angegeben.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde finanziell durch den Forschungszuschuss der Fakultät für Chemie der Adam-Mickiewicz-Universität Posen und die Satzungsaktivität Nr. S/PB/004 der Abteilung für Zellbiologie der Fakultät für Biologie der Adam-Mickiewicz-Universität Posen unterstützt. Wir möchten Professor Giovanni Petrillo von der Universität Genua (Italien) für die Möglichkeit danken, die Ringöffnungsreaktion von Nitrothiophenen durchzuführen.

Lukasz Piosik ist verstorben.

Abteilung für bioaktive Produkte, Fakultät für Chemie, Adam-Mickiewicz-Universität in Posen, Uniwersytet Poznańskiego 8, 61-614, Posen, Polen

Arleta Sierakowska & Beata Jasiewicz

Abteilung für Zellbiologie, Fakultät für Biologie, Adam-Mickiewicz-Universität in Posen, Uniwersytet Poznańskiego 6, 61-614, Posen, Polen

Lukasz Piosik & Lucyna Mrówczyńska

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Konzeptualisierung, BJ und LM; Investigation, AS, Ł.P. und LM; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, AS, Ł.P., BJ und LM; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, AS, BJ und LM; Finanzierungseinwerbung, BJ, LM; Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Beata Jasiewicz oder Lucyna Mrówczyńska.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sierakowska, A., Jasiewicz, B., Piosik, Ł. et al. Neue C8-substituierte Koffeinderivate als vielversprechende Antioxidantien und zytoprotektive Wirkstoffe in menschlichen Erythrozyten. Sci Rep 13, 1785 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-27205-8

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Eingegangen: 19. September 2022

Angenommen: 28. Dezember 2022

Veröffentlicht: 31. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27205-8

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