Bewertung polyanionischer Cyclodextrine als hochaffine Bindungsgerüste für Fentanyl

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2680 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wurde zuvor gezeigt, dass Cyclodextrine (CDs) mäßige Gleichgewichtsbindungsaffinitäten (Ka ~ 100–200 M-1) für das synthetische Opioid-Analgetikum Fentanyl aufweisen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Synthese neuer CDs mit verlängerten Thioalkylcarboxyl- oder Thioalkylhydroxyl-Einheiten und bewerten ihre Bindungsaffinität gegenüber Fentanylhydrochlorid. Die untersuchte optimale CD zeigt eine bemerkenswerte Affinität für das Opioid von Ka = 66.500 M−1, dem größten bisher für einen solchen Einschlusskomplex gemeldeten Wert. Eindimensionale 1H-Kernspinresonanz- (NMR) und Rotational Frame Overhauser Spectroscopy (2D-ROESY)-Experimente, unterstützt durch Molekulardynamiksimulationen (MD), deuten auf ein unerwartetes Bindungsverhalten hin, wobei Fentanyl in der Lage ist, das CD-Innere in einer von zwei unterschiedlichen Orientierungen zu binden . Die aus den MD-Simulationen abgeleiteten Bindungsenergien korrelieren stark mit NMR-abgeleiteten Affinitäten, was den Nutzen als Vorhersageinstrument für die Optimierung von CD-Kandidaten unterstreicht. Die Leistung dieser Wirtsmoleküle deutet auf ihren Nutzen als Plattformen für medizinische Gegenmaßnahmen bei Opioidexposition, als Biosensoren und in anderen forensischen wissenschaftlichen Anwendungen hin.

Synthetische Opioide auf Fentanylbasis haben im medizinischen Bereich zahlreiche Anwendungen als wirksame Anästhetika gefunden und gelten bei perioperativen Eingriffen als sicherer als Morphin1,2,3. Ihre starke Aktivität beruht auf ihrer Fähigkeit, verschiedene nozizeptive Rezeptoren im Nervensystem zu binden, wobei einer ihrer Hauptziele der μ-Opioidrezeptor ist4,5. Wie Morphin und andere Alkaloide zur Schmerzbekämpfung weisen Fentanyle aufgrund ihrer euphorisierenden Wirkung auf das Zentralnervensystem (ZNS) leider ein hohes Abhängigkeits- und Suchtrisiko auf. Leider hat ihr illegaler Gebrauch zu einer hohen Rate an überdosierungsbedingten Todesfällen geführt, was weitgehend als Fentanyl-Epidemie bezeichnet wird6,7,8,9.

Die Flaggschiffverbindung dieser Opioidklasse ist Fentanyl, das eine etwa 100-fache Wirksamkeit gegenüber Morphin aufweist (Abb. 1a)10,11. Obwohl sowohl Fentanyl als auch Morphin ein toxisches Potenzial aufweisen, wenn sie einer Person nicht sorgfältig verabreicht werden, ist Fentanyl aufgrund seiner viel einfacheren Herstellung oft besorgniserregender. Darüber hinaus ist die Herstellung neuartiger Analoga, die sich durch ein erhöhtes analgetisches Profil auszeichnen, angesichts der einfachen Synthese des Opioids nicht schwierig12,13,14. Zusätzlich zu ihrer medizinischen Verwendung wurden einige dieser Opioide wie Acetylfentanyl mit tödlichen Überdosierungsfällen bei Freizeitkonsum in Verbindung gebracht, während Carfentanil und Remifentanil mit der Verwendung als chemische Kampfstoffe in Verbindung gebracht wurden (Abb. 1b)15,16. Da die Wirksamkeit und Verwendung von Fentanyl-Opioiden in den letzten Jahrzehnten zugenommen hat17, konzentrierte sich die Forschung auf die Entwicklung effizienter Analysemethoden für ihren Nachweis9,16,18 und auf wirksame Gegenmittel, um ihren physiologischen Wirkungen entgegenzuwirken19,20. Gegenmittel wie Naloxon und Naltrexon (Abb. 1c) haben sich zu den wichtigsten Methoden zur Behandlung von Überdosierungen entwickelt, es mangelt ihnen jedoch immer noch an der Fähigkeit, einen längeren Schutz gegen diese synthetischen Opioide zu bieten. Diese verringerte Wirksamkeit ist auf die lange Zirkulationshalbwertszeit des Opioids im Blut zurückzuführen (t1/2 ~ 7–9 Stunden), während die Zirkulationshalbwertszeiten für Naloxon und Naltrexon mit t1/2 ~ 2 Stunden und t1/2 deutlich kürzer sind jeweils ca. 4 Std.19. Um dieses Problem anzugehen, haben Forschungsgruppen Programme ins Leben gerufen, die darauf abzielen, Kandidaten für medizinische Gegenmaßnahmen (MCMs) zu entwickeln, die einen längerfristigen Schutz gegen Fentanyle bieten, insbesondere wenn die betroffene Person von der medizinischen Notfallversorgung ausgeschlossen wird. Einige dieser Bemühungen drehten sich um die Idee, Wirtsmoleküle einzusetzen, die im Prinzip synthetische Opioide in ihrem Inneren einfangen könnten und je nach ihrer Bindungsaffinität dazu könnten diese wirksame Gerüste sein, die als MCMs verwendet werden könnten. Eine Klasse von Wirtssystemen, die von der Isaacs-Gruppe an der University of Maryland zu diesem Zweck und auch zur Umkehrung der Anästhesie eingehend untersucht wurde, sind die Cucurbit[n]urils21,22. Ihre Arbeit, die mit diesen zyklischen Wirten begann, führte schließlich zur Entdeckung eines leistungsstarken Wirts für Methamphetamin23 und Fentanyl24, der seltsamerweise azyklischer Natur war und ihm daher genügend Flexibilität verlieh, um seine effektive Einfangfunktion für das Opioid zu modifizieren. Eine weitere Gruppe ähnlicher Wirte, die jedoch auf einem Kohlenhydratrückgrat basieren, sind die Cyclodextrine, die für diese Anwendungen leider nur unzureichend untersucht wurden25.

(a) Chemische Strukturen von Fentanyl und Morphin; die Wirksamkeit des Opioids im Verhältnis zu Morphin (~ 100x) wird zusammen mit seiner Halbwertszeit im systemischen Kreislauf (t1/2) angegeben; (b) Strukturen von zwei der häufigsten Gegenmittel zur Behandlung von Fentanylvergiftungen, Naloxon und Naltrexon, sowie deren Halbwertszeiten im systemischen Kreislauf; (c) Strukturen von Fentanyl-Analoga, die in mehreren Fällen von Überdosierung in den USA vorkommen (Acetylfentanyl) sowie von anderen, die als handlungsunfähig machende Mittel verwendet werden (Carfentanil und Remifentanil), ihre Wirkungsstärken im Vergleich zu Morphin werden angegeben; (d) Struktur von β-Cyclodextrin, die die sieben Glucoseeinheiten zeigt, die in einer α1,4-Art verknüpft sind, wodurch eine konische Struktur (Frustrum) entsteht, die an beiden Enden offen ist und ein hydrophobes Inneres und ein hydrophiles Äußeres aufweist; (e) Darstellung eines hypothetischen Einschlusskomplexes zwischen β-CD und Fentanyl.

Cyclodextrine (CDs), zyklische Oligosaccharidmotive, die aus Glucosyleinheiten bestehen, die über α1,4-glykosidische Bindungen miteinander verbunden sind (Abb. 1d), haben in letzter Zeit als potenzielle Kandidaten für medizinische Gegenmaßnahmen Aufmerksamkeit erregt. Durch die zyklische Anordnung dieser Glucoseeinheiten entsteht ein makromolekulares Gerüst, das einem Kegelstumpf ähnelt, dessen unterer Rand größer ist als sein oberer Rand (Abb. 1e). Diese Anordnung verleiht CDs ein hydrophiles Äußeres und ein hydrophobes Inneres, das organische Moleküle aufnehmen kann, eine wichtige physikalische Eigenschaft dieser Verbindungen26,27. Diese Fähigkeit, als molekularer Wirt zu fungieren, hat CDs zu vielseitigen Plattformen für den Einsatz in der Industrie28, der Medizin29 und der Materialwissenschaft30 gemacht. Je größer die Anzahl der Glukoseeinheiten ist, desto größer ist natürlich der Hohlraum des Kegelstumpfs und desto größer ist seine Fähigkeit, größere Gäste in seinem Inneren aufzunehmen. Ein entscheidender und nützlicher experimenteller Ansatz für Forscher sind die Wirt-Gast-Komplexe, auch Einschlusskomplexe genannt, die mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht werden können, darunter UV-Vis31, Infrarot32 und Kernspinresonanzspektroskopie33 sowie spektrometrische Methoden wie Flüssigkeitschromatographie Massenspektrometrie (LC–MS)34. Unsere bisherige Arbeit stützte sich hauptsächlich auf NMR, um Komplexe zwischen nativen CDs und Fentanyl und anderen Toxinen zu untersuchen (Abb. 1e)25,35. Mithilfe umfangreicher NMR-Titrationsstudien in Verbindung mit zweidimensionaler Rotationsrahmen-Overhauser-Spektroskopie (2D-ROESY) können CD:Fentanyl-Bindungsaffinitäten sowie die Struktur des Komplexes bestimmt werden. Auch wenn bereits früher nachgewiesen wurde, dass sich Einschlusskomplexe zwischen nativen CDs und Fentanyl bilden, waren die Bindungsaffinitäten gering und nicht besonders stark, was ihre Verwendung als potenzieller Fentanylbinder rechtfertigen würde. In diesem Bericht stellen wir die Synthese komplexerer CD-Gerüste vor, bei denen beobachtet wurde, dass sie mit Fentanyl starke Einschlusskomplexe bilden. Unsere Bemühungen haben NMR-Titrationen genutzt, um die Bindungsstärke zwischen dem aktuellen Hauptkandidaten namens „Subetadex“ (SBX) und Fentanyl zu bestimmen. Darüber hinaus wurden mithilfe von 2D-ROESY-NMR-Experimenten wichtige Einblicke in die Struktur des SBX:Fentanyl-Komplexes gewonnen. Es wurde festgestellt, dass diese experimentellen Daten gut mit Computermodellberechnungen übereinstimmen, die auch zur Untersuchung weiterer CD-Gerüstkandidaten mit erhöhter Fentanylaffinität verwendet wurden.

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Erforschung komplexerer CD-Gerüste, die durch unsere ersten Studien zum Einfangen von Fentanyl mit nativen und einfach substituierten CDs25 sowie durch das Wissen über andere CD-Gerüste gefördert wurde, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur effektiven Bindung erfolgreich wichtige biomedizinische Anwendungen gefunden haben bestimmte Ziele neutralisieren. Ein solches CD ist Sugammadex (SGX), ein von der FDA zugelassenes Medikament zur Behandlung von Patienten, bei denen die postoperative anästhetische Wirkung von Rocuroniumbromid (RocBr) länger anhält36,37,38,39,40. SGX wurde 2001 bei Organon Laboratories36 entdeckt und zeigte eine starke Affinität zu RocBr bei gleichzeitiger Minimierung potenziell toxischer Nebenwirkungen. Nach Jahren der Evaluierung wurde SGX im Jahr 2015 von der FDA zugelassen und hat sich aufgrund seiner ungiftigen Natur und der starken komplexen Assoziationskonstante für das Medikament mittlerweile zu einer gängigen Behandlung zur Linderung der mit der Verwendung von RocBr im chirurgischen Umfeld verbundenen Anästhesiesymptome entwickelt Anästhetikum (Ka ~ 750.000 M-1), bestimmt durch Titrationsexperimente mit Kernspinresonanz (NMR)41. Wie bei SGX zielte die vorliegende Arbeit darauf ab, einen CD-Kandidaten mit einem ungiftigen Profil zu identifizieren, der gleichzeitig eine hohe Affinität zu Fentanyl und verwandten synthetischen Opioiden aufweist.

Strukturell basiert SGX auf einem γ-CD-Kern, dessen oberer Rand mit 3-Mercaptopropansäureketten chemisch modifiziert ist. Diese zusätzlichen Einheiten dienen dazu, das native hydrophobe Innere des CD zu verlängern. Basierend auf unseren früheren Studien25 wurde festgestellt, dass der γ-CD-Hohlraum zu groß ist, um Fentanyl in seinem Inneren aufzunehmen, und MD-Berechnungen zeigten, dass das Opioid den größten Teil der Simulationszeit ungebunden verbrachte. Aus diesem Grund konzentrierten sich die ersten Screening-Bemühungen auf β-Cyclodextrin-(β-CD)-basierte Gerüste, da ihr Inneres das Opioid besser aufnahm. Unsere früheren NMR-Daten und MD-Simulationen zeigten beide, dass Fentanyle natives β-CD am Fentanylamid-Phenylring binden, obwohl die beobachteten Bindungsaffinitäten recht niedrig waren (Ka < 250 M-1). Es wurde festgestellt, dass die aus diesen Daten ermittelten Strukturen dieser Komplexe den Großteil des Fentanylmoleküls außerhalb des CD belassen, wobei seine Phenethylgruppe weitgehend durch Wasser solvatisiert ist. Diese enthalpisch ungünstigen Wechselwirkungen erklären sich zum Teil durch die beobachteten schwachen Komplexe. Um die Komplexierung zu verbessern, wurden CDs ins Auge gefasst, die einen weitaus größeren Anteil des Opioids einschließen und dadurch günstigere Wechselwirkungen ermöglichen, hauptsächlich Van-der-Waals- und Coulomb-Wechselwirkungen34. Die in dieser aktuellen Arbeit untersuchte Bibliothek basiert auf dem β-CD-Wirt mit geringfügigen Variationen einer gemeinsamen Modifikation, nämlich dem Ersatz aller Hydroxylgruppen in Position 6 durch geradkettige Thioalkylcarboxylate oder Thioalkylalkohole (Abb. 2).

Grundlegendes Strukturschema eines βCD, dessen C6-Hydroxyleinheit am oberen Rand durch eine verallgemeinerte R-Gruppe ersetzt ist. In dieser Arbeit werden zwei Arten von Einheiten untersucht: Die anionischen Einheiten umfassen CDs mit den Gruppen 2-Mercaptoacetyl (SBX-1, 1), 3-Mercaptopropionoyl (SBX, 2) und 4-Mercaptobutanoyl (SBX + 1, 3). Bei der zweiten Art von Einheiten handelt es sich um diejenigen, die am oberen Rand neutrale Einheiten tragen, darunter 2-Mercaptoethanol (SBN-1, 4), 3-Mercaptopropanol (SBN, 5) und 4-Mercaptobutanol (SBN + 1, 6). Zusätzlich zu diesen βCD-basierten Zielen wurden auch SAX (Sualphadex, 7) und SGX (Sugammadex, 8) separat synthetisiert und bewertet, beide zeigten jedoch keine signifikante Bindung an Fentanyl.

Die Gleichgewichtsbindungsaffinitäten zwischen dem CD-Panel und Fentanyl·HCl wurden mithilfe von 1H-NMR-Titrationsexperimenten bestimmt. Um die genaueste Bindungskonstante abzuleiten, wurden Experimente so konzipiert, dass die CD-Konzentration [H]T (in Einheiten von M) wann immer möglich die Ungleichung [H]TK < 1 erfüllte. Erste Studien erforderten bestmögliche Schätzungen von K, da diese von vornherein unbekannt waren. Die chemischen 1H-NMR-Verschiebungen der Reporterprotonen auf CD (H3 und H5) wurden überwacht, während die Fentanyl-Titrierlösung schrittweise zugegeben wurde. Repräsentative Daten dieser Titrationen sind in Abb. 2 der Hintergrundinformationen zu finden. Die nichtlineare Anpassung der kleinsten Quadrate wurde unter Verwendung mathematischer Ausdrücke durchgeführt, die für die erhaltenen Bindungsdaten geeignet waren. Diese Anpassung wurde an allen Reporter-Protonen-Titrationskurven gleichzeitig durchgeführt und ergab eine globale Bindungsaffinität für jedes CD:Fentanyl-Paar25. Die Ergebnisse dieses Anpassungsverfahrens sind in der ersten Datenspalte von Tabelle 1 aufgeführt.

In den meisten Fällen könnten die NMR-Daten an ein Modell angepasst werden, das die Bindung als einfaches 1:1-System beschreibt. NMR-Job-Plot-Daten, die zur Rechtfertigung der Verwendung eines solchen Modells verwendet werden, zeigten jedoch eine deutliche Abweichung von einem 1:1-Bindungsmodell sowohl für SBX als auch für SBX + 1, wobei die Maxima leicht vom erwarteten Anteil r = 0,5 abwichen (siehe Abb. 1 in den Hintergrundinformationen). Diese Daten drängten auf die Berücksichtigung eines Zwei-Zustands-1:1-Modells, das in der Lage war, sowohl das beobachtete Job-Plot-Verhalten als auch das aus den Titrationen selbst zu beschreiben. Darüber hinaus zeigten die Titrationsdaten ein deutlich nicht-monotones Verhalten für mehrere Reporterprotonen (siehe Abbildung 2 in den Hintergrundinformationen).

Abbildung 3 vergleicht NMR-bestimmte Bindungsaffinitäten für 1:1-CD:Fentanyl-Komplexe mit MD-Simulationsbindungsenergien (Werte in den Spalten ganz rechts in Tabelle 1). Der Vollständigkeit halber sind Daten für α-CD und β-CD aus unserer früheren Arbeit enthalten. Für das anionische SBX-1, SBX und SBX + 1 (2–4) zeigen die NMR-Ergebnisse eine starke Korrelation mit dem durch die MD-Simulationen vorhergesagten Verhalten. Das heißt, die Bindungsaffinität nimmt mit der Bindungsenergie zu, was wahrscheinlich auf verstärkte Van-der-Waals-Wechselwirkungen zurückzuführen ist, die durch die hydrophobe Natur des verlängerten Rückgrats der anionischen Thioalkylcarboxylate entstehen. Diese Behauptung wird durch zusätzliche rechnerische Arbeiten gestützt, die ein Plateau in der Affinität für CDs zeigen, die weiter ausgedehnte anionische Arme aufweisen (z. B. SBX + 2 und SBX + 3 (nicht synthetisiert)). Diese Beobachtung zeigt, dass Thiocarboxylatarme, die länger als vier Kohlenstoffatome sind (z. B. SBX + 1), kaum Vorteile haben, da diese ausreichen, um das Fentanylmolekül vollständig zu umhüllen (d. h. optimale Größenkomplementarität). Wir sehen jedoch davon ab, direkte NMR/MD-Vergleiche überzuinterpretieren, da MD-abgeleitete Größen den Effekt der Konformationsentropie in der gesamten Thermodynamik vernachlässigen. Mit anderen Worten, eine freie Energie wird nicht streng berechnet. Stattdessen wird eine durchschnittliche Energie berechnet, die wie zuvor beschrieben als < U + W > bezeichnet wird41.

NMR-Bindungsaffinitäten (einfaches 1:1-Modell) im Vergleich zu enthalpischen Energien, ermittelt aus der Simulation für das dominante Konformer von Fentanyl, gebunden an die Wirte 1–6 und an α- und β-Cyclodextrin31. Beachten Sie, dass die hier angegebene Affinität für SBX + 1 die dominante Konformation des komplexeren Zweizustands-1:1-Modells (67 mM-1) ist. Neutrale CD-Gerüste sind als Kreise dargestellt. alle anderen als ausgefüllte Quadrate. Die durchgezogene Linie ist eine lineare Anpassung an gefüllte Datenpunkte unter Berücksichtigung von Messunsicherheiten. Die gestrichelte Linie hat die Steigung RT (0,602 kcal mol-1 bei 303 K).

Für die neutralen CDs (dh SBN-1, SBN und SBN + 1) sagten erste MD-Simulationen eine erhöhte Bindungsaffinität mit zunehmender Armlänge voraus, ähnlich wie bei ihren anionischen Gegenstücken. NMR-Daten zeigen jedoch einen dramatischen Rückgang der Bindungsaffinität, der sich mit zunehmender Armlänge tatsächlich verschlechtert (siehe Tabelle 1, Abb. 1). NMR-Strukturdaten aus ROESY-Experimenten zeigen klare Korrelationen zwischen den inneren H3- und H5-Protonen des CD und denen entlang seiner Thioalkylhydroxylarme (siehe Hintergrundinformationen). Zusätzliche MD-Simulationen dieser neutralen CDs allein in Lösung unterstützten dieses Verhalten. Letztendlich scheint die hydrophobe Antriebskraft, die dafür sorgt, dass sich die hydrophoben Thioalkylhydroxylarme innerhalb des CD-Hohlraums ausrichten, die Bindung von Fentanyl über einen kompetitiven Selbstbindungseffekt auszuschließen, wobei längere Arme innerhalb des Hohlraums besser binden. Wir schließen daraus, dass die Thiocarboxylatarme der geladenen CDs nicht nur für die notwendige Wasserlöslichkeit des CD sorgen, sondern, was wohl noch wichtiger ist, wahrscheinlich den anionischen SBX weit genug offen halten, damit Fentanyl über elektrostatische Abstoßung binden kann. Hinweis: MD legt nahe, dass zwischen den Carboxylat-Terminus und dem Fentanyl-Molekül nur eine geringe Wechselwirkung besteht, da sich die geladenen Gruppen in ihrer wässrigen Umgebung ausrichten.

Die bisher präsentierten Ergebnisse stellen eine vereinfachte Ansicht der Strukturdetails der SBX:Fentanyl-Komplexe dar. Wie bereits erwähnt, zeigten NMR-Daten in Form von Job-Plots (siehe Abbildung 1 in den Hintergrundinformationen), die zur Bestimmung der Wirt:Gast-Stöchiometrien42,43,44 verwendet werden, ein komplexeres Bindungsverhalten, von dem ursprünglich angenommen wurde, dass es von einem 1:2 herrührt oder 2:1 Host:Gast-Komplex. MD-Simulationen zeigten jedoch, dass CD kein zweites Fentanylmolekül aufnehmen konnte. Zusätzliche Simulationen zeigten jedoch, dass die geladenen CDs Fentanyl in zwei unterschiedlichen Konformationen aufnehmen können (Abb. 4). Im Fall von SBX-1 ist die Ausrichtung, bei der die Amidhälfte von Fentanyl „nach unten“ in Richtung der anionischen Kettenenden zeigt, gegenüber Fentanyl in die entgegengesetzte Richtung energetisch leicht begünstigt (siehe Abb. 4a). Für SBX + 1 ist die umgekehrte Konfiguration bevorzugt, wobei die Amidhälfte nach „oben“ zum unmodifizierten sekundären Rand von CD zeigt (siehe Abb. 4b). Beide Konformationen erwiesen sich als günstig, mit relativ geringen Energieunterschieden zwischen ihnen (0,8–5,8 kcal mol-1 je nach Wirtsmolekül, Abb. 4c). Für SBX sind die beiden Konformationen gleichermaßen günstig.

MD-Ergebnisse für den Wirt:Gast-Komplex mit zwei Orientierungen: (a) Fentanyl (Kohlenstoffatome in Cyan) nach „unten“ ausgerichtet mit der Amidhälfte nahe dem primären Rand von SBX (Kohlenstoffatome in Grün), (b) Fentanyl abwechselnd nach „oben“. " Position innerhalb von SBX, c) Bindungsenergien für alle drei SBX-Komplexe.

MD-Ergebnisse stimmen mit NMR-Experimenten der rotierenden Kern-Overhauser-Effekt-Spektroskopie (ROESY) überein. Abbildung 5 zeigt das zweidimensionale ROESY-Spektrum einer SBX + 1:Fentanyl-Mischung (siehe auch Abbildung 3 in den Hintergrundinformationen). Von besonderer Bedeutung ist das völlige Fehlen von Korrelationen zwischen Methylenprotonen am anionischen CD-Arm und aromatischen Protonen am Amidstickstoff-gebundenen Phenylring. Vielmehr wurden nur Korrelationen zwischen diesen Methylenen und den phenethylaromatischen Protonen von Fentanyl gefunden. Dieser Befund weist darauf hin, dass die Mehrzahl der Fentanylmoleküle in der „oben“-Orientierung bindet, was mit den MD-Ergebnissen übereinstimmt. ROESY-Daten für ein SBX-1:Fentanyl-Gemisch zeigen eine ähnliche Übereinstimmung wie MD-Daten, nämlich dass Amidphenylprotonen mit inneren CD-Protonen in der Nähe seines unmodifizierten sekundären Randes korrelieren. Diese Spitzen liefern einen klaren Beweis dafür, dass der Komplex die Orientierung nach „unten“ bevorzugt. Für alle drei geladenen CDs zeigen die Job-Plot-Daten (siehe ausgewählte Daten in Abb. 1 der Hintergrundinformationen) Hinweise auf ein Zwei-Zustands-Bindungssystem, ungeachtet des Fehlens klarer Korrelationen in den ROESY-Spektren. Jobplots sind bei der Erkennung dieser Art von Phänomenen viel empfindlicher, da sie einen wesentlich größeren relativen Konzentrationsbereich (d. h. [H]0/[G]0-Verhältnis) abdecken als Titrationsexperimente.

Partielles ROESY-Spektrum des SBX + 1:Fentanyl-HCl-Komplexes. Korrelationen zwischen aromatischen Fentanylprotonen aus dem Phenethylring und SBX + 1-Methylenen werden durch das gestrichelte Kästchen hervorgehoben. Das vollständige Spektrum ist in Abb. 3 der Hintergrundinformationen dargestellt.

Der Nachweis einer Gleichgewichtskoexistenz der beiden Konformationen impliziert, dass das oben erwähnte 1:1-Bindungsmodell nicht unbedingt für die Extraktion von Gleichgewichtsbindungsaffinitäten geeignet ist. Wir haben daher ein Anpassungsmodell entwickelt, das explizit beide Ausrichtungen der Titrationsdaten der chemischen Verschiebung berücksichtigt. Einzelheiten zu diesem „selbstkonkurrierenden“ Modell finden Sie in den Hintergrundinformationen. Die Ergebnisse der Anpassung an ein solches Modell ergaben zwei Gleichgewichtsbindungskonstanten. Für SBX:Fentanyl wurde beobachtet, dass der größere der beiden Ka-Werte dem aus dem 1:1-Modell abgeleiteten statistisch ähnlich war. Sekundäre Bindungskonstanten, die auf den schwächeren Komplex hinweisen, werden ebenfalls extrahiert, aber es war allein mit Titrationsdaten möglich, bestimmte Konformationen eindeutig Affinitäten zuzuordnen, da die damit verbundene relative Population so gering war. Die offensichtliche Übereinstimmung der NMR-ROESY-Daten mit den MD-Ergebnissen scheint jedoch darauf hinzudeuten, dass die aus den NMR-Daten ermittelten dominanten Konformationen diejenigen mit den höchsten berechneten Energien (dh den enthalpisch günstigsten) sind, wie in Abb. 3 dargestellt. Allerdings sind die Anpassungsparameter Die Ergebnisse dieser physikalisch relevanteren Anpassung sind aufgrund der Anzahl und der hohen Korrelation zwischen den Anpassungsparametern viel weniger robust als die Ergebnisse des 1:1-Modells. Aus diesem Grund haben wir in Abb. 1 die Bindungskonstanten aufgetragen, die für das robustere 1:1-Modell erhalten wurden (mit SBX + 1 als Ausnahme, da die Daten nicht einigermaßen gut an das einfache Modell angepasst werden konnten).

Reagenzien und Lösungsmittel wurden wie erhalten gekauft und verwendet. Methyl-3-mercaptopropionat, Cäsiumcarbonat und 2-Mercaptoethan-1-ol wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA) bezogen. Methylthioglykolat wurde von Pfaltz und Bauer, Inc. (Waterbury, CT) gekauft. Methyl-4-sulfanylbutanoat wurde von Enamine Ltd. (Kiew, Ukraine) gekauft. N-Methyl-2-pyrrolidon wurde von Applied Biosystems, Thermo Fisher (Grand Island, NY) gekauft. 4-Mercaptobutan-1-ol und 3-Mercaptopropan-1-ol wurden wie zuvor beschrieben45,46 synthetisiert, durch Flash-Säulenchromatographie in Kieselgelkartuschen mit einem Biotage Isolera-Reinigungssystem gereinigt und ihre Reinheit durch 1H-NMR und GC-MS47 bewertet. 48,49. Deuteriertes Wasser (D2O) wurde von Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA) bezogen. Hexakis-, Heptakis- und Octakis-C6-bromierte Cyclodextrine wurden von Arachem/Cyclodextrin Shop (Tilberg, Niederlande) bezogen. Thiol-vermittelte Verdrängungsreaktionen an den C6-perbromierten Cyclodextrinen, gefolgt von Methylesterhydrolyse (sofern zutreffend), wurden mit einer modifizierten Version des ursprünglich von Adam et al. veröffentlichten Protokolls durchgeführt36. Für die Synthese von Mercaptoalkylcarbonsäuremethylester-Zwischenprodukten wurde Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet, um ihre Produktion unter Verwendung von Merck-Kieselgel-60-F254-Blättern zu überwachen. Die Detektion erfolgte mit UV-Licht (λ = 254 nm) in Verbindung mit der Farbentwicklung mit Ce( SO4)2/(NH4)6Mo7O24·4H2O/H2SO4/H2O (CAM)50,51,52,53 und Joddampf54,55,56. Die Zentrifugation wurde in einer Eppendorf-Zentrifuge Modell 5810R bei 3220 U/min für 5 Minuten unter Verwendung von Falcon-Röhrchen (50 ml) durchgeführt, die von VWR (Aurora, CO.) erworben wurden. Die Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer des Modells IKA RV8 entfernt, der an eine KNF-Lab-Vakuumfiltrationspumpe und ein VWR RS-232-Kühl-/Umwälzsystem (9 °C Wasser/Ethylenglykol 1:1) gekoppelt war.

1H-NMR-Spektren (600 MHz), 13C-NMR-Spektren (150 MHz) und 13C-DEPT-NMR-Spektren (150 MHz) wurden in D2O aufgezeichnet, sofern nicht anders angegeben. Die Spektren wurden mit einem Bruker Avance III 600 MHz-Gerät, ausgestattet mit einer Bruker TCI 5 mm Kryosonde (Bruker Biospin, Billerica, MA) bei 30,0 ± 0,1 °C aufgenommen. NMR-Daten für die unten aufgeführten synthetisierten Verbindungen werden wie folgt angegeben: chemische Verschiebung (δ) (Teile pro Million, ppm); Multiplizität: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), dd (Dublett von Dubletts), td (Triplett von Dubletts), m (Multiplett), app (scheinbar) und br (breit); Kopplungskonstanten (J) werden in Hertz (Hz) angegeben. Für die experimentellen Daten, die bei der Charakterisierung von Wirt-Gast-Komplexen verwendet werden, wurden eindimensionale 1H-NMR-Daten mit Wasserunterdrückung durch Anregungsformung mit Gradienten gesammelt57. Für jedes 1-D-Experiment wurden 16 bis 128 Transienten (abhängig von der Analytkonzentration) mit 65.536 Datenpunkten, einer Erfassungszeit von 4,0 s und einer Relaxationsverzögerung von 1,0 s erfasst. Vor der Fourier-Transformation wurden die freien Induktionszerfälle (FIDs) mit einem exponentiellen Zerfall apodisiert, der einer Linienverbreiterung von 0,25 Hz entspricht. Zweidimensionale ROESY-Spektren wurden unter Verwendung von 16.384 Datenpunkten mit 1024 Inkrementen, 8–32 Scans für jedes Inkrement und einem kontinuierlichen Spinlock mit einer Mischzeit von 200 ms und einer Frequenz von 3,57 kHz erfasst. Weitere Einzelheiten finden Sie in unserer vorherigen Veröffentlichung25. Genaue Massen der unten synthetisierten Verbindungen wurden auf einem Bruker micrOTOF-Q III (Bruker Daltonics, Billerica, MA) erhalten, der mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet war. Die massenspektroskopische Flugzeitdetektion wurde im Negativionenmodus durchgeführt. Die Massenkalibrierung wurde in den letzten Minuten jedes Laufs mit dem ESI-L Low Concentration Tuning Mix (G1969-85.000) von Agilent durchgeführt. Für die Trennung aller Verbindungen wurde ein Agilent 1260-Flüssigkeitschromatograph (LC) verwendet, der mit einer Atlantis T3-Umkehrphasensäule (C18, 150 mm × 2,1 mm, 3 μm Partikelgröße, Waters, Milford, MA) ausgestattet war. Die mobile LC-Phase bestand aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (A) und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (B). Das Gradientenprofil begann mit 95 % A für 2 Minuten, stieg nach 18 Minuten auf 5 % A an, hielt es 13,5 Minuten lang, stieg innerhalb von 0,5 Minuten schnell wieder auf 95 % an und wurde zur Säulenregeneration 10 Minuten lang gehalten. Diese Methode wurde für alle Proben verwendet, mit Ausnahme derjenigen für die Untersuchung der Vinylfliesenoberfläche, bei der die endgültigen 5 % A 18,5 Minuten lang gehalten wurden. Zehn Mikroliter der flüssigen Probe wurden über einen Autosampler (Agilent B1329B) in die Injektionsöffnung eingeführt.

Die Gleichgewichtsbindungskonstanten zwischen der CD-Familie und Fentanyl-HCl wurden mithilfe von 1H-NMR-Titrationsexperimenten bestimmt. Um die genaueste Bindungskonstante abzuleiten, erfüllte die Cyclodextrinkonzentration [H]T (in Einheiten von M) wann immer möglich die Ungleichung [H]TK < 1. Erste Studien erforderten bestmögliche Schätzungen von K, da diese von vornherein unbekannt waren. Letztlich war diese Bedingung für alle Verbindungen erfüllt, mit Ausnahme von SBX + 1, wo die erforderliche Konzentration zu einem inakzeptablen Signal-Rausch-Verhältnis führte. Die Verwendung dieser nicht idealen Konzentration führt zu einer größeren Unsicherheit in der abgeleiteten Bindungskonstante (siehe unten). Aufgrund der begrenzten Wasserlöslichkeiten der neutralen Verbindungen 5–7 (< 1 mg·mL-1 in allen Fällen) wurden alle Titrationen bei [H]T < 0,1 mM durchgeführt. Jedes der modifizierten CDs wurde in deuteriertem Wasser (D2O) auf ein Gesamtvolumen von 500 μl gelöst, wobei 1 μl Acetonitril als Referenzpunkt für die chemische Verschiebung hinzugefügt wurde. Anschließend wurde Fentanyl-HCl in die Lösung titriert. Die gesamte (an Cyclodextrin gebundene + frei in Lösung befindliche) Fentanyl-HCl-Konzentration [G]T (in M-Einheiten) wurde variiert, um den Konzentrationsbereich zwischen \(\frac{\left(0,2{\left[H\right]) abzudecken. }_{T}+0.25\right)}{K}\) und \(\frac{\left(0.8{\left[H\right]}_{T}+4\right)}{K}\) um eine genaue Extraktion der Bindungskonstanten zu ermöglichen. An jedem Titrationspunkt wurden die chemischen Protonenverschiebungen (bezogen auf Acetonitril bei 2,014 ppm) der H1-, H3-, H5- und H6-Protonen auf der CD aufgezeichnet; Die Subtraktion der chemischen Verschiebung, die vom ersten Datenpunkt erhalten wurde, der nur aus dem Cyclodextrin bestand, ergab eine Differenz zwischen der gebundenen und der freien chemischen Verschiebung \(\Delta {\delta }_{i}\) für jedes Reporterproton i. Die resultierenden Kurven von \(\Delta {\delta }_{i}\) versus [G]T wurden dann zunächst angepasst (Mathematica 10, Wolfram) unter Verwendung eines nichtlinearen Algorithmus der kleinsten Quadrate, der zuvor besprochen wurde (siehe zusätzliche mathematische Details im Supporting). Informationen)31. Wie in unserer vorherigen Arbeit sind die Bindungskonstante K und ein Empfindlichkeitsfaktor für die chemische Verschiebung \(\Delta {\updelta }_{c,i}\) für jedes Reporterproton die passenden Parameter. Die Beschränkung von K auf einen einzelnen Wert für jede NMR-Titrationskurve ergibt eine globale Bindungskonstante, die Daten aller Reporterprotonen berücksichtigt58. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die angegebenen K-Werte für jede Verbindung sind der Durchschnitt und die Standardabweichung der drei Experimente.

Molekulardynamik (MD) wurde mit AMBER59 (Version 12) durchgeführt, wobei die aktuellen Ladungen und Parameter für Cyclodextringerüste60,61 und das GAFF-Kraftfeld für die verschiedenen Fentanyle62 in ihren protonierten Zuständen63 verwendet wurden. Fentanylladungen wurden durch AM1-BCC-Berechnungen55 im Programm ANTECHAMBER generiert. Zur Modellierung der CD:Fentanyl-Komplexierungsprozesse wurde das Programm CHIMERA eingesetzt64. Die CD- und CD:Fentanyl-Komplexe wurden in einer Kiste mit TIP3P-Wasser solvatisiert, deren Größe ausreichend war, um mindestens 15 Å Wasser zwischen dem gelösten Stoff und der Lösungsmittelgrenzfläche zu haben (~ 51 × 51 × 51 Å3 anfängliche Kastengröße)65. Um die Systeme zu neutralisieren, wurden dem System ausreichend Natriumionen (Na+) (typischerweise eins) zugesetzt. Die Systeme bestanden aus etwa 12.500 Atomen (~ 4.100 Wassermolekülen). Die Energie jedes Systems wurde durch 250 Stufen des steilsten Abstiegs und 1500 Stufen des konjugierten Gradienten minimiert. An diesen minimierten Systemen wurden konstante Temperatur- und Druckdynamiken (NPT) durchgeführt66,67. Es wurden periodische Randbedingungen verwendet und elektrostatische Wechselwirkungen mit Partikelnetz-Ewald-Methoden unter Verwendung eines 9-Å-Grenzwerts im direkten Raum mit einem 1-Å-Gitter68 behandelt. Wasserstoffhaltige Bindungen wurden mit SHAKE eingeschränkt und für jede Simulation wurde ein Zeitschritt von 2 fs verwendet69. Die Systeme wurden zunächst für die ersten 100 ps an ein Wärmebad bei 100 K gekoppelt, dann für die nächsten 100 ps auf 200 K erhöht und schließlich für den Rest der Simulation auf 300 K erhöht. Jede Simulation wurde je nach CD-Gast für insgesamt 10 ns oder 30 ns durchgeführt. Anfängliche Simulationen umfassten nur einzelne Trajektorien, es wurde jedoch allgemein beobachtet, dass sich die βCD-Struktur während der Simulation nicht wesentlich änderte und dass die quadratische Abweichung der Nichtwasserstoffatome relativ zur durchschnittlichen Struktur schnell um 1 ns ein Plateau erreichte. Die ersten 2,5 ns der 300-K-Dynamik wurden zur Äquilibrierung verwendet. Um umfassendere Daten und statistische Informationen zu erhalten, wurden zehn Wiederholungssimulationen (jeweils 10 ns) für Komplexe zwischen allen vier geladenen Fentanylen und βCD durchgeführt, bei denen das Gastmolekül parallel zum breiteren CD-Rand lag. Diese Replikationssimulationen zeichneten sich dadurch aus, dass der Startwert zur Erzeugung der Anfangsgeschwindigkeiten für das System geändert wurde.

Die freie Bindungsenergie zwischen den Cyclodextrinen und Fentanylen wurde mithilfe der Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area (MM-GBSA)-Methode aus Schnappschüssen der solvatisierten Trajektorien70,71,72,73 geschätzt. MM-GBSA-Energieberechnungen wurden an Replikationssimulationen durchgeführt und dann gemittelt, um die durchschnittliche Bindungsenergie für ein bestimmtes Fentanyl:CD-System zu erhalten. Die freie Bindungsenergie wurde durch die Gleichung geschätzt:

Für jeden Term wird G als die Summe der molekularmechanischen Gasphasenenergie EGas und der Solvatationsenergie Gsol geschätzt:

Der Beitrag der Entropie wurde bei diesen Berechnungen der freien Energie vernachlässigt. Die freie Solvatationsenergie (Gsol) ist die Summe der polaren und unpolaren Solvatationsenergien der Moleküle, die durch Lösen der verallgemeinerten Born-Gleichung (GB) bestimmt wird. Die freien Bindungsenergien für die Komplexe wurden mithilfe des MMPBSA.py-Skripts in AMBER12 anhand von Schnappschüssen von jeder 7,5-ns-Trajektorie berechnet. Für die Berechnung wurde das modifizierte Onufriev-Bashford-Case-I GB (ib = 2)-Modell mit einer Fentanylsalzkonzentration von 0,24 mM74 verwendet. Die zur Berechnung des unpolaren Beitrags zur freien Solvatisierungsenergie verwendete Oberflächenspannung betrug 0,0072 kcal mol-1 Å-2.

In dieser Arbeit haben wir die Einschlusskomplexe zwischen einer Reihe chemisch modifizierter CDs und dem synthetischen Opioid Fentanyl untersucht. Die ausgewertete Gruppe von CDs wies an ihrem oberen Rand entweder anionische Thioalkylcarbonsäure-Seitenketten oder neutrale Thioalkylalkohol-Seitenketten auf. Es wurde festgestellt, dass die geladenen CDs über ausgedehnte hydrophobe Innenräume verfügen, die durch gegenseitige elektrostatische Seitenkettenabstoßung offen gehalten werden und so eine ausreichende Bindungstasche für das Opioid bieten. MD-Simulationen der SBX:Fentanyl-Einschlusskomplexe stimmten mit den aus NMR-Experimenten ermittelten Bindungsaffinitätstrends überein. Das heißt, dass die Bindungsstärke bei den drei untersuchten geladenen CDs mit zunehmender Länge des modifizierten Arms zunimmt. Bei CDs mit neutralen Thioalkylseitenketten wurde beobachtet, dass die Bindungsaffinitäten mit zunehmender Armlänge abnahmen, was wahrscheinlich auf die konkurrierende Bindung der hydrophoberen neutralen Seitenketten zurückzuführen ist, die auch die hydrophoben SBN-Innenräume anstreben. MD-Simulationen unterstützten dieses Phänomen der kompetitiven Bindung ebenfalls und zeigten, dass längere Arme tendenziell stärker mit dem hydrophoben Inneren interagieren. Für die Gruppe vielversprechender geladener SBXs wurde festgestellt, dass die maximale Fentanyl-Bindungsaffinität Ka = 66.500 M-1 für SBX + 1 beträgt. Nach unserem Kenntnisstand ist dies die größte Gleichgewichtsbindungsaffinität, die für CD:Fentanyl-Komplexe berichtet wurde. Wir glauben, dass diese CD-Gerüste zu vielversprechenden, neuartigen Kandidaten für medizinische Gegenmaßnahmen gegen diese potenziell tödlichen Opioide entwickelt werden könnten. Ein weiterer wichtiger Weg für zukünftige Untersuchungen, der derzeit jedoch nicht behandelt wird: die potenzielle Leistungsfähigkeit der gleichzeitigen Anpassung von Job-Plot- und Titrationsdaten, um zuverlässigere Werte stark korrelierter Anpassungsparameter zu extrahieren. Unsere Gruppe konzentriert sich auch auf die Nutzung dieser Verbindungen zum Abfangen von Fentanylen in der Umwelt sowie zum Nachweis dieser Opioide in komplexen biologisch-forensischen Proben.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des US-Energieministeriums vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DE-AC52-07NA27344 durchgeführt. Die Arbeit wurde vollständig durch einen laborgesteuerten Forschungs- und Entwicklungszuschuss (14-ERD-048) an CAV finanziert

Direktion für Physik und Biowissenschaften, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, 94550, USA

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau und Carlos A. Valdez

Abteilung für Nuklear- und Chemiewissenschaften, Lawrence Livermore National Laboratory, 7000 East Avenue, Livermore, CA, L-090 94550, USA

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau und Carlos A. Valdez

Forensic Science Center, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, 94550, USA

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy und Carlos A. Valdez

Abteilung für Biowissenschaften und Biotechnologie, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA, 94550, USA

Edmond Y. Lau

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CAV synthetisierte und reinigte alle in dieser Arbeit verwendeten Verbindungen. BPM und DJK führten alle 1D- und 2D-NMR-Experimente durch. EYL führte alle molekulardynamischen Simulationen und Docking-Experimente durch. CA V und BPM haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Carlos A. Valdez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mayer, BP, Kennedy, DJ, Lau, EY et al. Bewertung polyanionischer Cyclodextrine als hochaffine Bindungsgerüste für Fentanyl. Sci Rep 13, 2680 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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Eingegangen: 16. November 2022

Angenommen: 08. Februar 2023

Veröffentlicht: 15. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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