Hydrogele für die RNA-Lieferung

Naturmaterialien (2023)Diesen Artikel zitieren

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RNA-basierte Therapeutika haben sich bei der Behandlung von Krankheiten auf genetischer Ebene als äußerst vielversprechend erwiesen, und einige wurden für den klinischen Einsatz zugelassen, darunter die jüngsten COVID-19-Messenger-RNA-Impfstoffe. Der klinische Erfolg der RNA-Therapie hängt weitgehend vom Einsatz chemischer Modifikationen, Ligandenkonjugation oder nicht-viraler Nanopartikel ab, um die RNA-Stabilität zu verbessern und die intrazelluläre Abgabe zu erleichtern. Im Gegensatz zu Ansätzen auf molekularer oder nanoskaliger Ebene handelt es sich bei makroskopischen Hydrogelen um weiche, wassergequollene dreidimensionale Strukturen, die bemerkenswerte Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, einstellbare physiochemische Eigenschaften und Injizierbarkeit aufweisen und in letzter Zeit große Aufmerksamkeit für den Einsatz in der RNA-Therapie erregt haben. Insbesondere können Hydrogele so konstruiert werden, dass sie eine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle über die Freisetzung von RNA-Therapeutika ausüben, wodurch möglicherweise die systemische Toxizität minimiert und die In-vivo-Wirksamkeit verbessert wird. Dieser Aufsatz bietet einen umfassenden Überblick über die Hydrogelbeladung von RNAs und das Hydrogeldesign für die kontrollierte Freisetzung, beleuchtet ihre biomedizinischen Anwendungen und bietet unsere Perspektiven auf die Chancen und Herausforderungen in diesem spannenden Bereich der RNA-Verabreichung.

Nukleinsäurebasierte Therapien wie DNA, Antisense-Oligonukleotide (ASOs), Small Interfering RNAs (siRNA) und Messenger-RNAs (mRNA) werden in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen häufig eingesetzt. Als eine Art Nukleinsäure, die für alles bekannte Leben essentiell ist, spielen RNA-Moleküle zahlreiche regulatorische Rollen, wie zum Beispiel die Steuerung der Proteinexpression und die Modulation gezielter Gene1,2,3. Bisher wurden mehrere RNA-Therapeutika, hauptsächlich siRNA und mRNA, für verschiedene Krankheiten klinisch zugelassen (Tabelle 1), viele andere befinden sich in klinischen Studien. mRNA hilft dem Körper, seine eigenen fehlenden, defekten oder funktionellen exogenen Proteine ​​(z. B. Antigene) herzustellen4, während siRNA die Expression endogen exprimierter Proteine ​​oder pathologischer Proteine ​​reduziert5. Darüber hinaus wurden auch microRNAs (miRNAs) und andere nicht-kodierende RNAs zur Regulierung der Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene untersucht6.

Trotz des beträchtlichen therapeutischen Potenzials von RNAs wurde über Einschränkungen bei ihrer In-vivo-Abgabe berichtet, darunter enzymatische Anfälligkeit, extrazelluläre und zelluläre Barrieren sowie Schwierigkeiten beim Transport in das subzelluläre Kompartiment, wo die Ladung aktiv sein wird1. Daher basieren die meisten RNA-Therapien im klinischen Stadium auf chemischer Modifikation (z. B. Phosphorothioat-Verknüpfung), Ligandenkonjugation (z. B. N-Acetylgalactosamin (GalNAC)) oder der Abgabe nicht-viraler Nanopartikel (NP) (z. B. Lipid). NP)7. Insbesondere verbessert die chemische Modifikation die enzymatische und metabolische Stabilität8 und die Ligandenkonjugation verbessert die Abgabe an bestimmte Organe und Zelltypen9. Schließlich schützen NPs eingekapselte RNA und verbessern die Pharmakokinetik und den endosomalen Escape10. Diese Verabreichungsmethoden weisen jedoch ihre eigenen Einschränkungen auf, da weitere Verbesserungen hinsichtlich der Transfektionseffizienz11, der Spezifität der Organ-/Zellübertragung12, der RNA-Stabilität13 und der Umgehung der Immunaktivierung14 erforderlich sind, was möglicherweise die Entwicklung völlig unterschiedlicher Kategorien von Verabreichungssystemen erfordert. In diesem Sinne wurden in jüngster Zeit erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Verwendung makroskaliger Hydrogele für die Abgabe von RNA-basierten Therapeutika sowie eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen zu erforschen, die von der Gen-Stummschaltung und dem Proteinersatz bis hin zur Immunmodulation reichen (Abb. 1)15,16, 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40.

Farbige Kästchen zeigen die Art der biomedizinischen Anwendung an: Krebstherapie (orange), Knochenregeneration (blau), Immunmodulation (gelb), Herzreparatur (rot) und Angiogenese (grau). ACpG-STAT3, Cytosin-Phosphorothioat-Guanin-Signalwandler und Aktivator der Transkription 3; DextranVS, Dextranvinylsulfon; GelMA, Gelatinemethacryloyl; HP-HA-PEG, ein Thiol-modifiziertes Analogon von Heparin-Thiol-modifiziertem Hyaluronan-Poly(ethylenglykol)-diacrylat; Hyd, Hydrogel; IL, Interleukin; MPEG, Methoxypolyethylenglykol; mTOR, Säugetierziel von Rapamycin; PAA, Polyacrylamid; PCL, Poly(ε-caprolacton); PE, Polyethylen; PEG4SH, tetrathioliertes Polyethylenglykol; PEI-DA, Desoxycholsäure-modifizierte Polyethylenimin-Polymerkonjugate; PLA-DX-PEG, Poly-d,l-milchsäure-p-dioxanon-polyethylenglykol-blockcopolymer; PLK, Serin/Threonin-Proteinkinase; Rb1/Meis2, Retinoblastoma1/meis Homöobox 2; RGM, RNA-Gen für miRNAs; SPARC, sezerniertes Protein, sauer und reich an Cystein15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40.

Hydrogele bestehen aus einem wassergequollenen dreidimensionalen Netzwerk, das die intrinsischen Eigenschaften der nativen extrazellulären Matrix (ECM) nachahmt, was sie unter anderem für Anwendungen in der Gewebezüchtung, der Arzneimittelabgabe und der zellulären Morphogenese nützlich macht41,42. Die einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften von Hydrogelen ermöglichen die Aufrechterhaltung der biologischen RNA-Aktivität, die Beibehaltung und anhaltende Freisetzung von RNA als lokale Transportträger (z. B. injizierbare Systeme) und die bedarfsgerechte Lieferung hoher Konzentrationen von Nutzlasten an einen Zielort /pulsierende Weise über reizresponsive Strategien (Abb. 2)43,44. Somit könnten Hydrogele die RNA-Stabilität verbessern, unnötige Verluste von Therapeutika im Zusammenhang mit der systemischen Verabreichung reduzieren, unerwünschte Toxizitäten außerhalb des Ziels mildern und die Notwendigkeit mehrerer Dosen vermeiden. All dies macht Hydrogele zu einem attraktiven System für die Verabreichung von RNA-basierten Therapeutika, das die oben genannten Plattformen im klinischen Stadium ergänzt.

Hydrogele bieten eine einzigartige Strategie für die lokale Verabreichung von RNA und überwinden einige der Schwierigkeiten, die mit der systemischen RNA-Verabreichung verbunden sind. Sie ermöglichen eine lokalisierte, kontrollierte und nachhaltige Abgabe hoher Nutzlastmengen unter Beibehaltung der biologischen RNA-Aktivität. Dadurch können Off-Target-Effekte und die Notwendigkeit mehrerer Nutzlastverabreichungen bei der systemischen Bereitstellung vermieden werden.

Überzeugende Belege für die Anwendung von Hydrogelen zur Abgabe von RNAs und anderen Nukleinsäuren wurden seit der ersten Verwendung von Polymerpellets zur anhaltenden Freisetzung von Nukleinsäuren im Jahr 1976 gesammelt Hydrogele für die kontrollierte Abgabe von RNAs, heben die jüngsten Fortschritte bei biomedizinischen Anwendungen hervor und bieten Perspektiven auf die Herausforderungen und Chancen in diesem aufstrebenden Forschungsgebiet.

RNA kann entweder durch direkten Einschluss der nackten RNA oder durch Einkapselung von RNA-Nanoträgern in Hydrogele geladen werden (Abb. 3). Die Beladung mit nackter RNA hängt weitgehend von den physikalisch-chemischen Wechselwirkungen zwischen der RNA und dem Hydrogelnetzwerk ab. Im Vergleich dazu bieten Nanoträger möglicherweise eine verbesserte RNA-Bioaktivität, eine bessere Kontrollierbarkeit der RNA-Freisetzung und eine bessere Ausrichtung auf bestimmte Zellen, während die Beladung von den Wechselwirkungen der Nanoträger mit dem Hydrogel abhängt.

a: RNA wird entweder ohne Manipulation (nackte RNA) oder mithilfe von Nanoträgern in das Hydrogel geladen. b, RNA-beladene Hydrogele können als implantierbare Gerüste oder als injizierbare Gele für die lokale RNA-Abgabe verwendet werden. Die fein abstimmbaren physikalischen, biochemischen und biologischen Eigenschaften von Hydrogelen ermöglichen die anhaltende und/oder kontrollierbare Freisetzung von RNA. Beim Eintritt in die Zelle (z. B. über nackte RNA oder RNA-beladene Nanoträger) erreicht die RNA das richtige subzelluläre Kompartiment, um die Proteinproduktion/-hemmung einzuleiten.

Für das Laden nackter RNAs in Hydrogele wurden mehrere Strategien entwickelt, beispielsweise elektrostatische Wechselwirkung, kovalente Konjugation, Wirt-Gast-Wechselwirkung oder Kombinationen davon (Abb. 4). Hier stellen wir jede Strategie und die zugehörigen Hydrogele vor und diskutieren ihre Eigenschaften für die Bereitstellung nackter RNA.

RNA-Therapeutika können über ionische Bindungen zwischen negativ geladenen RNA-Teilen und positiv geladenen Hydrogel-Netzwerkteilen mit Hydrogel-Netzwerken interagieren; Wasserstoffbrückenbindungen, die entstehen, wenn positiv geladene Wasserstoffatome in einen bestimmten Radius um ein elektronegatives Akzeptoratom gelangen; kovalente Bindungen, die die RNA chemisch mit Polymer-Hydrogelketten verbinden; hydrophobe Interaktionen, die modifizierte RNA nutzen; und unspezifische Interaktionen.

Kationische/ionisierbare Polymere und Lipide, die am häufigsten untersuchten nicht-viralen Transportmaterialien, können mit negativ geladenen Biomolekülen interagieren, was ionische Bindungen zu einer einfachen und robusten Methode für die Einkapselung von RNAs und anderen Nukleinsäuren in Hydrogelen macht46. Allerdings können synthetische Polykationen vor allem aufgrund ihrer hohen positiven Ladung eine mäßige bis hohe Toxizität verursachen. Darüber hinaus haben synthetische kationische Polymere im Allgemeinen ein niedriges Molekulargewicht und eine stark verzweigte Struktur, was ihre potenziellen Anwendungen bei der Hydrogelbildung einschränken kann. Daher wurde die Konjugation synthetischer und natürlicher Polykationen an Hydrogele oder die Verwendung von Hydrogelen, die ausschließlich auf natürlichen Polykationen basieren, entwickelt, um diese Bedenken auszuräumen37,47. Beispielsweise wurden mehrere verschiedene biologisch abbaubare Polymere und Herstellungssysteme für die lokalisierte Abgabe nackter siRNA untersucht: mit Kalzium vernetztes Alginat, fotovernetztes Alginat und säurelösliches Kollagen47. siRNA wurde aus den stark negativ geladenen Alginat-Hydrogelen innerhalb einer Woche schnell freigesetzt, aufgrund der Wirkung der Amingruppen dauerte es jedoch mehr als zwei Wochen, bis sie aus dem Kollagen-Hydrogel freigesetzt wurde. Der Einbau von positiv geladenem Polyethylenimin (PEI) oder Chitosan verzögerte die siRNA-Freisetzung zusätzlich. Darüber hinaus sind ionische Bindungen anfällig für pH-Änderungen, die die anhaltende Freisetzung der beladenen Biomoleküle behindern können. Faktoren wie die Anzahl und Art der Ladungsgruppen (z. B. primäre, sekundäre und quartäre Aminogruppen und Amidingruppen) pro einzelnem Polymer können ebenfalls dabei helfen, das endgültige Freisetzungsprofil zu bestimmen.

Neutral geladene Polymere wie Polyvinylalkohol (PVA) können durch die Wechselwirkung des positiven Wasserstoffatoms an Nukleinsäuren binden, wodurch eine elektrostatische Verbindung mit elektronegativen Akzeptoratomen hergestellt wird48. Solche Polymere können mit bestimmten chemischen Einheiten weiter modifiziert werden, um intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Hydrogel und den RNAs zu verstärken. In ähnlicher Weise wurde untersucht, ob negativ geladene Polysaccharide wie Alginat und Hyaluronsäure (HA) die kontrollierte Freisetzung von RNAs fördern, die auch mit zusätzlichen Einheiten modifiziert werden können, um die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zu den eingekapselten Nukleinsäuren zu erhöhen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass HA-PVA-Hydrogele siRNA in vitro langsamer freisetzen als PVA-Hydrogele, was auf eine höhere Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der siRNA und dem HA-Rückgrat zurückzuführen ist49. Es ist wichtig zu betonen, dass es sich bei Wasserstoffbrücken hauptsächlich um schwache elektrostatische Wechselwirkungen handelt, die möglicherweise keine starke Bindung von RNAs an die Hydrogele induzieren. Folglich werden manchmal Wasserstoff- und Ionenbindungen kombiniert, um die Wechselwirkungen zwischen dem Hydrogel und den RNAs zu verstärken, indem der Hydrogelformel kationische Moleküle oder Polymere hinzugefügt werden39,50.

Die kovalente Konjugation von RNAs an das Rückgrat von Hydrogelen ermöglicht die homogene und vorhersagbare Verteilung einer großen Menge an RNAs mit minimaler anfänglicher Burst-Freisetzung. Obwohl diese Methode bei der Verabreichung von Arzneimitteln mit kleinen Molekülen sehr verbreitet ist, gibt es nur sehr wenige Beispiele für kovalent bindende RNAs51. Beispielsweise wurde siRNA über die Michael-Additionschemie kovalent an die photovernetzten Dextran-Hydrogele gebunden. Beim hydrolytischen Abbau von Ester- und/oder Disulfidbindungen verlängerte sich die Profilfreisetzung von siRNA um bis zu 10 Tage im Vergleich zur ungebundenen Verbindung, die in den ersten 12 Stunden freigesetzt wurde. Durch Anpassen der abbaubaren Bindungen oder der Menge an angebundener siRNA im Hydrogelnetzwerk ist es möglich, die Ladungsmenge und deren Profilfreisetzung zu steuern. Allerdings birgt die Konjugation von siRNA in das Hydrogelnetzwerk einen zusätzlichen technischen Aufwand.

Hydrophobe Wechselwirkungen erfolgen durch die Bildung eines Clathratkäfigs, einer eisähnlichen Matrix aus Wassermolekülen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen gebildet wird, um den Hydrophoben52. Die Wirt-Gast-Paare lassen sich relativ einfach synthetisieren und können mit biologischen Molekülen interagieren, wobei die Wechselwirkung typischerweise von der Molekülgröße und Hydrophobie abhängt. Gast-Wirt-Paare werden häufig für die Herstellung injizierbarer Hydrogele verwendet, vor allem aufgrund ihrer dynamischen Bindungen, die sich neu bilden können44. Beispielsweise zeigte Cyclodextrin (CD) eine relativ geringe Toxizität und eine hohe Wasserlöslichkeit29, wodurch eine Reihe hydrophober Gastmoleküle in ihren inneren Hohlräumen eingebettet werden konnten53. HA wurde mit CD als Wirt oder mit Adamantan als Gast modifiziert, die sich selbst zu injizierbaren Hydrogelen zusammensetzten. Das HA-Assemblierungssystem ermöglicht die Bildung komplexer CD-Cholesterin-modifizierter miR-302-Wechselwirkungen für die lokale und anhaltende Freisetzung von miRNA40. Die Freisetzung von miRNA aus dem HA-Hydrogel-Netzwerk wird über drei Wochen gemessen (In-vitro-Studien) und erfolgt schneller als die Erosion des Hydrogels. Daher wird die Hypothese aufgestellt, dass miRNAs aus dem Hydrogelnetzwerk diffundieren, was die entscheidende Rolle der anionischen Abstoßung von HA gegen miRNA und der Gast-Wirt-Wechselwirkungen des Hydrogels unterstreicht.

Als alternativer Ansatz können supramolekulare Hydrogele auch durch Selbstorganisation biokompatibler niedermolekularer Hydrogelbildner gebildet werden, die durch intramolekulare π-π-Stapelung von Hydrogelbildnermolekülen und RNAs ausgelöst wird. Beispielsweise konnte mit Ureido-Pyrimidinon-Einheiten (UPy-PEG) modifiziertes Polyethylenglykol (PEG) in Wasser dimerisieren und ein faseriges supramolekulares Hydrogel erzeugen54. siRNA und miRNA wurden kovalent mit Cholesterin konjugiert, um direkt mit dem hydrophoben Kern der Faser zu interagieren, wodurch die Freisetzung von siRNA und miRNA-Profilen fein abgestimmt wird. Andernfalls können supramolekulare Hydrogelbildnermoleküle (z. B. Tetrazol und Spiropyran) hinzugefügt werden, um hydrophobe Wechselwirkungen mit den hydrophoben Seitenketten von Aminosäuren innerhalb der eingekapselten RNA-Strukturen zu erleichtern55. Allerdings muss in diesen Hydrogelen das Verhältnis von hydrophoben Einheiten zu hydrophilen Bereichen sorgfältig angepasst werden, um die Wasseraufnahmekapazität zu bewahren. Es sollte auch beachtet werden, dass solche hydrophoben Wechselwirkungen nicht von der RNA selbst abhängen, sondern vom hydrophoben Modifikator auf der RNA.

In einigen Fällen wird die RNA-Beladung in Hydrogelen lediglich durch unspezifische Wechselwirkungen vermittelt. Die RNA-Freisetzung kann daher einfach durch diffusionskontrollierte Mechanismen gesteuert werden, die im folgenden Abschnitt ausführlich erörtert werden. Beispielsweise könnte man die Vernetzungsdichte erhöhen und dadurch die Quellung und die Arzneimittelfreisetzungsrate verringern oder die makromolekulare Maschengröße durch Veränderung der makromolekularen Struktur verringern und so die Arzneimittelfreisetzungszeit verlängern. Dies ist häufig bei wärmeempfindlichen Hydrogelen wie Poly(N-isopropylacrylamid)56 der Fall, die bei In-vivo-Verabreichung gebildet werden können, ausgelöst durch den Sol-zu-Gel-Phasenübergang. Eine wesentliche Einschränkung bei Thermohydrogelen ist ihre mangelnde biologische Abbaubarkeit, die durch die Copolymerisierung mit biologisch abbaubaren Polymeren behoben werden könnte. Die begrenzte Kontrolle über das RNA-Freisetzungsprofil kann durch den Einbau kationischer Polymere weiter überwunden werden.

Die Lieferung von RNA-Nanoträgern (z. B. Liposomen/Lipid-NPs, Polymer-NPs und anorganischen Nanomaterialien), die in ein Hydrogel-Netzwerk geladen sind, könnte die chemische Modifikation von RNA und Hydrogel-Polymeren vermeiden und die Beladung, Stabilität und Transfektionseffizienz im Vergleich zu nackten RNA-Strategien verbessern ( Abb. 3)3. Nachfolgend skizzieren wir die Beladung mehrerer repräsentativer RNA-Nanoträger in Hydrogelen.

Kationische/ionisierbare Lipide können entweder in Form von Liposomen oder RNA/Lipid-Komplexen wie Lipoplexen und Niosomen57 verwendet werden. Fibrin-Gele sind in der Lage, die Zellmigration zu unterstützen und gleichzeitig die Lentivirus-Aktivität aufrechtzuerhalten58. Die Oberfläche eines auf Fibrin basierenden Hydrogels wurde mit siRNA-beladenem Lipofectamin konjugiert, um den Grad der zellulären Internalisierung zu erhöhen und Antagonisten (z. B. Noggin) auszuschalten59. Ungefähr 20 % der freien siRNA oder der mit Lipofectamin komplexierten siRNA verblieben nach 3 Tagen auf der Fibrinoberfläche, was darauf hindeutet, dass die negative Ladung von Fibrin offenbar keinen Einfluss auf die Oberflächenretention von Nanokomplexen hat. Andererseits zeigte die Verwendung injizierbarer Chitosan-Alginat-Gerüste, die mRNA-Lipoplexe enthalten, die Fähigkeit, eine lokale In-vivo-Transfektion zu induzieren und die Antikörperproduktion und die T-Zell-Proliferationsraten im Vergleich zur systemischen Verabreichung nur von mRNA-Lipoplexen zu erhöhen60. Bemerkenswerterweise gibt es immer noch eine begrenzte Anzahl veröffentlichter Studien mit RNA-Liposomen-beladenen Hydrogelen, was durch die thermodynamische Instabilität von Liposomen und deren weitere Aggregation in einem geladenen Hydrogel erklärt werden könnte61.

Kationische Polymere wie Polyethylenimin (PEI), Chitosan und Poly(l-lysin) (PLL) werden häufig zur Herstellung von Polyplexen verwendet62. Im Gegensatz zu Nanoträgern auf Lipidbasis sind kationische Polymere vollständig wasserlöslich, da sie im Allgemeinen keine hydrophoben Einheiten enthalten46. Darüber hinaus haben kationische Polymere die Fähigkeit, Nukleinsäuren auf eine kleinere Größe zu komprimieren als kationische Lipide. Ein potenzieller Nachteil von RNA-Polymer-Nanoträgern besteht darin, dass es bei einigen weichen und geladenen NPs während des Ladens zu einer Aggregation kommen kann, was die Menge an RNA, die in das Hydrogel geladen werden kann, einschränken kann63. Kollagenbasierte Hydrogele, die der natürlichen ECM sehr ähneln, wurden für die lokale Abgabe von RNA-Nanokomplexen verwendet. Ein spezifisches Kollagenhydrogel war in der Lage, siRNA/PEI-Nanokomplexe in vitro über einen Zeitraum von 10 Tagen nachhaltig abzugeben32. Allerdings könnten die Fremdproteine ​​in Kollagenhydrogelen eine Fremdkörperreaktion auslösen, die ihre biologische Anwendung behindern könnte64. In diesem Sinne könnten HA-basierte Hydrogele eine der bevorzugten Optionen für die RNA-Abgabe sein65. Mit Cyclooxygenase manipulierte miRNA-Plasmide (COX-1 und COX-2) wurden auf PLGA/PEI-NP-Komplexe geladen und dann in HA-Hydrogele eingebettet65. Im Vergleich zu Plasmid/NP-Komplexen wurde ein langsameres, nachhaltigeres Freisetzungsprofil aus dem Hydrogel festgestellt. Mögliche Wechselwirkungen polymerer Nanoträger mit dem Hydrogel könnten die Freisetzungsrate beeinflussen. Tatsächlich wurde über die Aggregation und Deaktivierung von RNA-beladenen NPs in Hydrogelen berichtet63. Um dieses Problem anzugehen, können bei der Entwicklung solcher Abgabesysteme die Beschichtung von NPs mit Agarose66, die kovalente Bindung von NPs an das Hydrogel-Rückgrat67 oder ähnliche Strategien angewendet werden.

Anorganische kolloidale NPs (z. B. Gold, Eisenoxid, Siliciumdioxid und Quantenpunkte) wurden in der RNA-Therapie hauptsächlich wegen ihres einfachen Syntheseprozesses und ihrer breiten Verfügbarkeit verwendet3. Beispielsweise wurden PEI-basierte Hydrogele mit siRNA-Au-Fe3O4-Nanokapseln konjugiert. Die subkutane Verabreichung von Nanokapsel-Hydrogel zeigte eine bessere Tumorpenetration und eine längere Blutzirkulationszeit im Vergleich zur intravenösen Verabreichung von Nanokapseln allein22. Natürlich ermöglichen AuNPs eine Vielzahl von Funktionalisierungen über die Gold-Thiol-Konjugation und werden häufig in multimodalen Ansätzen eingesetzt68. Multifunktionale Quantenpunkt-DNA-Hydrogele, die Doxorubicin und siRNA enthalten, reduzierten die EGFR-Expression deutlich stärker als siRNA allein69. Quantenpunkt-DNA-Hydrogele können ohne toxische Transfektionsmittel als Transportvektor fungieren und haben eine hohe therapeutische In-vivo-Wirksamkeit gegen Brustkrebs gezeigt. Die Kombination von anorganischen Kern-Hydrogel-Gerüsten mit kolloidalen NPs eröffnet die Möglichkeit neuer Gerüststrukturen mit unterschiedlicher Kerngröße, Ladung, Beschichtungen und physikalischer Dehnung/Kompression von Hydrogelen.

Das Profil der RNA-Freisetzung aus dem manipulierten Hydrogel-Netzwerk, einschließlich der Dauer der RNA-Verfügbarkeit (kurzfristig gegenüber langfristig) und des Freisetzungsmusters (kontinuierlich gegenüber pulsierend), hängt stark von der Zielanwendung ab. Infolgedessen wurden mehrere Hydrogel-Designs eingesetzt, um die kontrollierte Freisetzung von RNAs durch passive oder aktive Mechanismen zu erleichtern. Während passive Mechanismen eine kontinuierliche kurz- und langfristige Freisetzung ermöglichen können, können aktive Mechanismen zu pulsierenden Freisetzungsmustern führen. Im folgenden Abschnitt wird ein umfassender Überblick über diese Mechanismen für die kontrollierte Freisetzung nackter RNAs oder RNA-Nanoträger aus Hydrogelen gegeben (Abb. 5).

a: Das endgültige Freisetzungsprofil der eingekapselten nackten RNA und/oder RNA-Nanoträger wird durch die physikalischen Eigenschaften des Hydrogels und die RNA-Hydrogel-Wechselwirkungen bestimmt. b: Bei lokaler Verabreichung kann die Freisetzung der eingekapselten RNA durch äußere oder innere Reize ausgelöst werden. c, Illustrative Freisetzungsprofile von eingekapselter nackter RNA und/oder RNA-Nanoträgern. d, Illustrative Bioverteilungsprofile von RNA-Therapeutika, die in nackter Form oder in Kombination mit einem Hydrogelsystem verabreicht werden. e, Illustrative lokale Akkumulationsprofile der Nutzlast an der Implantationsstelle in nackter Form oder in Kombination mit einem Hydrogelsystem.

Die kontinuierliche passive Freisetzung aus Hydrogelen wird durch die Einzelwirkung oder die Kombination von Faktoren wie Diffusion, Abbau des Hydrogelnetzwerks und Hydrogelquellung erreicht. Aus diesem Grund kann die passive Freisetzung durch die Entwicklung von Hydrogelmerkmalen wie Molekulargewicht, Matrixkonzentration, Vernetzungsdichte, Hydrophilie und Porengrößenverteilung33,70,71 zusätzlich zu den oben genannten Hydrogelchemien für die Interaktion mit RNAs angepasst werden.

Hydrolytisch abbaubare Funktionalitäten wie Estergruppen wurden in das Hydrogel-Rückgrat eingebaut, um die Freisetzungsrate zu steuern72. Zu diesem Zweck wurde basierend auf Thiol-En-Wechselwirkungen ein in situ gebildetes Hydrogel unter Verwendung einer Kombination von achtarmigem Thiol-modifiziertem PEG (8-arm-PEG-SH) mit entweder achtarmigem acrylmodifiziertem PEG (8-arm-PEG-SH) hergestellt. arm-PEG-A), das eine Estergruppe an jedem Arm enthält, oder achtarmiges Mono(2-acryloyloxyethyl)succinat-modifiziertes PEG (8-arm-PEG-MAES), das drei hydrolysierbare Estergruppen an jedem Arm enthält73. Das Hydrogel mit den höheren Esterbindungen in den makromolekularen Netzwerken (8-Arm-PEG-MAES) zeigte im Vergleich zu den beiden anderen eine schnellere Quellung und einen schnelleren Abbau, was zu einer schnelleren Freisetzung von RNA-PEI-Nanokomplexen führt (85,09 ± 2,43 % über 19 Tage). Hydrogel-Formulierungen.

Die Freisetzungsrate kann durch Anpassen der Nanoträgergröße und -konzentration weiter angepasst werden28. Photovernetzte DEX-Hydrogele (DEX-HEMA) wurden über eine biologisch abbaubare Esterbindung kovalent mit kationischem linearem PEI-Methacrylat (LPEI-GMA) funktionalisiert74. siRNA interagiert elektrostatisch mit dem kationischen linearen PEI. Daher wurde die Freisetzung des siRNA-Profils durch die Abbaurate von DEX-HEMA-Hydrogeln über biologisch abbaubare Esterbindungen und den Grad der siRNA/PEI-Wechselwirkungen fein abgestimmt, die durch die Steuerung des Hydrogels (8 und 12 Gew.-%) und/oder des Nanoträgers erreicht wurden (0, 5 und 10 μg) Konzentration. Die Hydrogele konnten die siRNA über lange Zeiträume (9 bis 17 Tage) freisetzen. Bemerkenswerterweise kann die beobachtete anhaltende Profilfreisetzung von RNA aus dem Hydrogelnetzwerk über einen langen Zeitraum (Wochen) schädlich für die Auslösung einer signifikanten physiologischen Reaktion sein. Tatsächlich kann die geringe Menge an RNA, die aus dem Hydrogel-Netzwerk freigesetzt wird, nicht ausreichen, um einen Zieleffekt zu fördern, den eine systemische Verabreichung (oder mehrere lokale Verabreichungen) erreichen kann.

Um die mit der passiven Freisetzung verbundenen Probleme anzugehen, wurde die bedarfsgesteuerte Abgabe von RNAs aus den Hydrogelen mithilfe aktiver Freisetzungsmechanismen erreicht. Die aktive Freisetzung erfolgt als Reaktion auf interne (z. B. pH-Wert und Enzym) oder externe Reize (z. B. Photostrahlung), was den bedarfsgesteuerten Abbau des Hydrogelnetzwerks erleichtern und somit die RNA-Freisetzung fördern kann. Der Auslöser der RNA-Freisetzung durch externe Reize führt zu einer zusätzlichen Kontrolle der RNA-Abgabe in definierten Dosen und über bestimmte Zeiträume und bietet so eine Alternative zu vom Arzt oder Patienten verabreichten Strategien.

pH-responsive Hydrogele enthalten häufig Schiff-Base-Bindungen, die bei pH 7,4 stabil sind, in einer sauren Umgebung (z. B. pH 6,8) jedoch aufgebrochen werden75. Solche Hydrogele eignen sich für die bedarfsgesteuerte Freisetzung von RNA bei Krankheiten, die mit einer sauren Gewebemikroumgebung einhergehen (wie Krebs und Myokardinfarkt (MI)). Beispielsweise wurde ein pH-empfindliches Hydrogel basierend auf einer Kombination aus miRNA-beladenen aminfunktionalisierten mesoporösen Silica-NPs (MSNs), Aldehyd-funktionalisiertem PEG (PEGCHO) und α-CD76 erstellt. Die Hydrogelherstellung beruht auf Schiff- und hydrophoben Wechselwirkungen zwischen PEGCHO, α-CD und MSN. In einer leicht sauren Umgebung (pH 6,8) werden Schiffsche Basenbindungen gespalten, um eine funktionelle Aldehydgruppe zu erzeugen, und MSN/miR-21-5p wird aus dem Hydrogel (75 % für 1 Woche in vitro) in die Infarktregion freigesetzt. Bei einem pH-Wert von 7,4 wurden nur 6 % der MSN/siRNA-Nanokomplexe aus dem Hydrogel freigesetzt. Interessanterweise war die Menge der bei pH-Stimuli freigesetzten RNA als MI-Behandlung wirksam.

Enzymempfindliche Hydrogele enthalten normalerweise ein Polymernetzwerk, das mit einem enzymempfindlichen Peptidlinker vernetzt ist77. In Gegenwart eines bestimmten Enzyms (z. B. Matrix-Metallopeptidase 2 (MMP-2), Protease, Trypsin und Lysozym) wird der Peptidlinker aufgebrochen, was zur Freisetzung der eingeschlossenen RNA-Therapeutika aus den Hydrogelen führt. In diesem Sinne wurden HA-basierte Hydrogele durch Hydrozonenbindungen (d. h. Aldehyd-modifizierte HA und Hydrazid-modifizierte HA) und durch Protease abbaubare Peptidvernetzer gebildet78. Anschließend wurde CD-modifiziertes HA in das Hydrogelsystem eingeführt, um cholesterinmodifizierte siRNA zu binden, wie zuvor beschrieben40. Wie erwartet wurde das Hydrogel erodiert und siRNA, die auf MMP2 abzielte, wurde als Reaktion auf die Proteasespiegel (z. B. Kollagenase) für die MI-Behandlung freigesetzt60. In einer anderen Studie wurde ein durch MMP-2 abbaubares Hydrogel mit Tumorwachstumsfaktor-β1-siRNA-Polyplexen beladen, die weiter an elektrogesponnenen Fasern adsorbiert wurden79. Hohe MMP-2-Konzentrationen förderten eine schnellere Freisetzung von Polyplexen aufgrund des Abbaus des MMP-2-Substratpeptids in den Hydrogelen, wohingegen die Zugabe von MMP-2 fast keinen Einfluss auf die siRNA-Freisetzung aus den Hydrogelen hatte, die MMP-2-nicht abbaubare Vernetzer enthielten.

Auf Licht reagierende Hydrogele bieten eine bedarfsgerechte räumliche und zeitliche Kontrolle. Im Allgemeinen enthalten diese Hydrogele einzelne oder mehrere photospaltbare Einheiten (z. B. Nitrobenzyl-basierte Linker mit Ester- oder Amidbindungen) mit variablen Abbaueigenschaften als Reaktion auf die Wellenlänge und Intensität des Lichts sowie die Bestrahlungszeit. Während nackte RNA über photolabile Bindungen an das Hydrogelnetzwerk gebunden ist, sind die RNA-Nanoträger im Hydrogel eingekapselt und durch diese photoempfindlichen Bindungen vernetzt. Photoabbaubares PEG-di(photolabiles Acrylat) (PEG-DPA) wurde in diesen Hydrogelen konsequent als Baustein verwendet50. Bei Einwirkung von ultraviolettem (UV) Licht spalten sich Estergruppen, die an photolabile ortho-Nitrobenzylgruppen gebunden sind, in Acetal- und Säureeinheiten und fördern so die siRNA-Freisetzung. Photolabile Hydrogele wurden auch mithilfe der Michael-Addition hergestellt, um die Freisetzung von siRNA-PEI-Nanokomplexen zu steuern80. Die photoabbaubaren Hydrogele mit der geringsten Menge an photolabilen Einheiten zeigten einen Anstieg der hydrolytischen Abbaurate von Esterbindungen, was die Freisetzung von siRNA-Therapeutika steigert. Darüber hinaus wurde die Freisetzung des siRNA-Profils aus photolabilen Hydrogelen auch durch UV-Lichteinwirkung beeinflusst. Bemerkenswerterweise wurde die selektive Abgabe von miRNA durch die Verwendung von PEG-basierten Hydrogelen über eine kupferfreie Klickreaktion erreicht und mit UV-spaltbarem Chol-miR-26a konjugiert, was die Kontrolle über die miRNA-Freisetzung durch maßgeschneiderte UV-Bestrahlungszeit und UV-Intensität ermöglicht.

Insgesamt kann durch die richtige Gestaltung von Hydrogelen mit fotoabbaubaren Linkern eine bedarfsgerechte Freisetzung von RNA-Therapeutika bei UV-Strahlung erreicht werden. Aufgrund der geringen Durchdringung von UV-Licht sind diese Hydrogele jedoch möglicherweise nicht für den Einsatz in tiefen Geweben geeignet.

Die Hydrogelabgabe von RNA-Therapeutika wurde in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt (Tabelle 2). Hydrogele werden hauptsächlich verwendet, um die lokale Verabreichung von RNA-Therapeutika an die Krankheitsstelle zu erleichtern und die RNA vor angeborenen Immunreaktionen zu schützen. Abhängig von der Krankheitspathologie können Hydrogele jedoch so modifiziert werden, dass sie unterschiedliche Freisetzungsprofile ergeben und so die Wirksamkeit von RNA-Therapeutika maximieren. Im Folgenden beleuchten wir vor allem die Verwendung von RNA-Abgabe-Hydrogelen in der Krebstherapie, Knochenregeneration, Herzreparatur und Wundheilung (Abb. 6).

Die Verbindung von nackter RNA oder RNA-Nanoträgern mit multifunktionalen Hydrogelen kann vielfältige biomedizinische Anwendungen finden, beispielsweise in der Krebstherapie, Wundheilung, Knochenregeneration und Herzreparatur.

Eine systemische Krebsbehandlung ist bei Metastasierung hilfreich, geht aber auch mit systemischer Toxizität und möglicher Immunogenität aufgrund von Leckagen/Ansammlungen in wichtigen Organen einher. In diesem Zusammenhang könnten Hydrogele die langfristige und nachhaltige lokale Verabreichung von RNA-Therapeutika erleichtern, um potenzielle Nebenwirkungen zu reduzieren und gleichzeitig den Primärtumor anzugreifen24,67, den Primärtumor neu zu programmieren, um Metastasen zu verhindern81 und/oder das Wiederauftreten des Primärtumors nach einer chirurgischen Resektion zu hemmen68 . Dementsprechend können verschiedene Arten aktivierter Onkogen-mRNA oder miRNA durch die RNAi-Technologie wirksam gehemmt werden, um das Tumorwachstum zu hemmen. Beispielsweise können NPs, die RNA-Therapeutika (z. B. miRNA) enthalten, in eine Hydrogelmatrix eingebettet werden, die wiederum neben dem Tumor implantiert wird24,81. Bemerkenswerterweise demonstrierte ein Hydrogelnetzwerk, das aus einem Zweikomponentensystem besteht, nämlich Schiff-Base-Wechselwirkungen zwischen einem oxidierten Polysaccharid und einem aminhaltigen Dendrimer, die Verwendung des Verhältnisses von Aldehyd- zu Amingruppen zur Steuerung der Freisetzungsrate von RNA-Therapeutika. Allerdings können stark vernetzte Hydrogele die Freisetzung eingebetteter RNA-Therapeutika behindern und so die therapeutische Wirksamkeit verringern. Um dieses Problem anzugehen, wurden einkomponentige injizierbare Polyplex-Hydrogele verwendet, um RNA-Therapeutika (z. B. siRNA) mit höherer Effizienz zu verabreichen19,21. Typischerweise enthalten diese Polyplexsysteme eine wärmeempfindliche Einheit, die bei der Injektion in das Zielgewebe den Übergang von Sol zu Gel ermöglicht. Anschließend hängt die Freisetzungsrate der RNA-haltigen Polyplexe aus diesen Gelen von ihrer Auflösungsrate ab, die durch den Einbau abbaubarer Linker, die gegenüber Hydrolyse oder enzymatischer Aktivität empfindlich sind, weiter gesteuert werden kann. Folglich führt die Hydrogel-vermittelte Verabreichung von RNA-Therapeutika zur Krebstherapie zu einer längeren Retention der Nanovektoren um den Tumor herum, was die Aufnahme durch die jeweilige Krebszellpopulation fördert. Dies ist bei der Behandlung von Hirntumoren von entscheidender Bedeutung, da solche Plattformen in der Lage sind, biologische Barrieren (hauptsächlich die Blut-Hirn-Schranke) zu überwinden, um Therapeutika an das Hirngewebe abzugeben. Im Allgemeinen haben Hydrogele für die Abgabe von RNA-Therapeutika bei Krebs eine verbesserte Bioverfügbarkeit und eine erhöhte Tumorakkumulation mit weniger Homing in Nichtzielgeweben gezeigt. Im Zusammenhang mit Krebs beschränkt sich die Abgabe von RNA-Hydrogelen nicht nur auf die Stummschaltung onkogener Gene, und die nächste große Errungenschaft am Horizont könnte die Manipulation immunmodulatorischer Faktoren sein, um Immunzellen für die Krebsimmuntherapie zu rekrutieren82.

Die Knochenregeneration und -reparatur ist ein weiterer Bereich, in dem sich die Hydrogel-vermittelte RNA-Abgabe als vielversprechend erwiesen hat72,75. Die Knochenheilung beruht auf mehreren dynamischen und räumlich-zeitlichen Mechanismen, einschließlich Entzündungs-, Reparatur- und Umbauphasen auf entscheidender zellulärer (d. h. Entzündungszellen, Gefäßzellen, osteochondraler Vorläuferzellen und Osteoklasten) und molekularer Ebene (d. h. proinflammatorische Zytokine, Wachstum). Faktoren sowie angiogene und proosteogene Faktoren)83. Daher ist es für die Hydrogele von entscheidender Bedeutung, die räumlich-zeitliche und dosiskontrollierte Freisetzung von RNA-Therapeutika zu modulieren, um der hochkomplexen Mikroumgebung während der Knochenregeneration gerecht zu werden. Wenn die Hydrogele als Gerüst eingesetzt werden sollen, sollte ihr Abbau entsprechend mit der Geschwindigkeit des einwachsenden Gewebes korrelieren, um eine ausreichende mechanische Unterstützung zu gewährleisten. Angesichts dieser Anforderungen haben photoabbaubare Hydrogele ein enormes Potenzial gezeigt, die bedarfsgesteuerte Freisetzung von RNA-Therapeutika zu erleichtern80. In diesen Systemen enthalten die Hydrogele sowohl hydrolytisch abbaubare Bindungen (zum Beispiel Disulfid- und/oder Esterbindungen) als auch photolytisch abbaubare Stellen (Thiol-Acrylat-Bindungen). Daher induziert UV-Strahlung den Photoabbau photolabiler Bindungen im Hydrogelnetzwerk, was sich auf die physiochemischen Eigenschaften des Hydrogels wie Quellung und Abbaugeschwindigkeit auswirkt. Die Ergebnisse zeigten, dass UV-Strahlung zu einer schnelleren Freisetzung von siRNA aus diesen Hydrogelen führen kann und dass die damit verbundene Freisetzungsrate durch Anpassung des Verhältnisses der photolabilen Gruppen in der Hydrogelzusammensetzung weiter modifiziert werden kann. Hydrogele dieser Art ermöglichen eine zeitliche Abstimmung der RNAi-Präsentation direkt an der erkrankten Stelle, was bekanntermaßen die Knochenbildung fördert84. Obwohl in Forschungsstudien die Verabreichung osteogeneseinduzierender Therapeutika untersucht wurde, ist es auch möglich, zusätzliche Zellreaktionen zu untersuchen, einschließlich Angiogenese und Zellinfiltration.

MI resultiert aus einem Verschluss der Koronararterie und führt zu lokaler Ischämie, Gewebeschäden und letztendlich zu Herzversagen. Es gibt interessante Ansätze, die angewendet wurden, um die ECM-Homöostase und Angiogenese zu verbessern oder Fibrose und Kalziumungleichgewicht zu verhindern, nämlich die Abgabe von siRNA, miRNA und Short-Hairpin-RNA (shRNA)85. Bemerkenswert ist, dass die Verwendung von selbstheilenden Hydrogelen, die mit minimalinvasiven Ansätzen (z. B. Kathetern) in die Infarktstelle injiziert werden und sich nach Beendigung dieser Scherkräfte wieder neu bilden können, eine vielversprechende Option für die Herausforderung der Abgabe und Retention von RNAi-Therapeutika ist86 . Zu diesem Zweck wurde eine Vielzahl chemischer Mechanismen implementiert, darunter ionische Bindungen87 und dynamische kovalente Bindungen (Hydrazonbindungen25 und Gast-Wirt-Wechselwirkungen40), um injizierbare selbstheilende Hydrogele für die RNAi-Abgabe herzustellen. Unter anderem können Gast-Wirt-Hydrogele (mit CD-Molekülen) über hydrophobe Wechselwirkungen eine langsamere Freisetzung von cholesterinmodifizierter RNAi ermöglichen. Auf Reize reagierende Verknüpfungen (z. B. Protease-empfindlich78 und pH-empfindlich76) wurden auch als andere Mittel verwendet, um eine bedarfsgesteuerte Freisetzung aus injizierbaren selbstheilenden Hydrogelen zu erreichen. Diese beiden Reize wurden insbesondere ausgewählt, weil MI mit Veränderungen in der Mikroumgebung des Gewebes verbunden ist, einschließlich einer Senkung des pH-Werts (von 7,4 auf 6,8) und einer lokalen Hochregulierung der proteolytischen Aktivität. Dies unterstreicht die Bedeutung der Berücksichtigung der Krankheitspathologie bei der Entwicklung von Hydrogelen für die RNA-Abgabe. Im Allgemeinen besteht ein wesentlicher Vorteil der RNAi-Verabreichung mithilfe injizierbarer selbstheilender Hydrogele darin, dass die Verabreichung einer Einzeldosis solcher Systeme das infarzierte Myokard erheblich und kontinuierlich wiederherstellen und die Herzfunktion über einen längeren Zeitraum (von einem bis drei Monaten) verbessern kann. Angesichts der Rolle der Immunantwort beim Fortschreiten und der Reparatur von MI-Erkrankungen können Hydrogele eine wesentliche Rolle bei der Bereitstellung von RNA-Therapeutika zur Manipulation von Makrophagen und regulatorischen T-Zellen spielen, entzündungsfördernde Reaktionen begrenzen und regenerative Zytokine in der Infarktregion erhöhen.

Die Wundheilung ist ein gut orchestrierter und regulierter Prozess, der in drei sich überschneidende Phasen unterteilt werden kann: Hämostase und Entzündung, Proliferation und Gewebeumbau88. Dieser Prozess wird jedoch durch pathophysiologische Bedingungen stark gestört. RNAi-Therapeutika haben bereits gezeigt, dass sie alle drei Phasen ansprechen und somit die funktionelle Geweberegeneration erleichtern können. Hydrogele können sowohl bei der lokalen Verabreichung von RNAi-Therapeutika als auch bei der Bereitstellung einer künstlichen Matrix zur Unterstützung des Heilungsprozesses eine zentrale Rolle spielen. Beispielsweise wurden häufig thermoresponsive Hydrogele (z. B. Pluronic F-127, Methylcellulose und Agarose) verwendet, um miRNA oder siRNA zu transportieren und so die Wundheilung zu beschleunigen89. Ein Nachteil solcher Hydrogele könnte darin bestehen, dass die Freisetzungsrate der eingekapselten RNAi-Therapeutika nicht kontrolliert werden kann.

Um dieses Problem anzugehen, wurden sowohl physikalisch als auch chemisch vernetzte Hydrogele eingesetzt, und der Grad der Vernetzung wurde verwendet, um die Freisetzungsrate von RNAi-Therapeutika zu steuern. Ein häufiges Beispiel für physikalisch vernetzte Hydrogele ist der schichtweise Aufbau zweier entgegengesetzt geladener Biopolymere90. Eine Erhöhung der Anzahl der Schichten führte zu einer langsameren Freisetzung von RNAi-Therapeutika aus diesen Hydrogelen. Aufgrund ihrer physikalischen Beschaffenheit sind diese Gele in der Lage, RNAi über einen Zeitraum von zwei Wochen freizusetzen. Bei chemisch vernetzten Hydrogelen können auch andere Variablen die Freisetzungsrate von RNAi-Therapeutika beeinflussen. Dies hängt im Allgemeinen von den Einheiten ab, die an der Bildung der chemischen Vernetzungen innerhalb des Hydrogels beteiligt sind. Beispielsweise könnte die Vernetzung ein Ergebnis von Schiffschen Basenbindungen zwischen Aldehyd- und Amingruppen auf Polymermatrizen sein91. Diese Hydrogele werden oft über einen Zeitraum von einem Monat langsam abgebaut und ergeben daher ein längeres Freisetzungsprofil für RNAi-Therapeutika. Umgekehrt werden Hydrogele, die durch Wechselwirkungen zwischen der Polymermatrix und dem RNAi-Nanovektor entstehen, schneller abgebaut (maximal sieben Tage), was zu einem kürzeren Freisetzungsprofil führt92,93. In diesen Fällen besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Anzahl der aktiven funktionellen Gruppen auf dem Nanovektor und der entsprechenden Vernetzungsdichte des Hydrogels. Dadurch kann die Freisetzungsrate der eingekapselten RNAi einfach durch Anpassen der Konzentration des Nanoträgers im Hydrogel eingestellt werden. Insbesondere können Nanoträger mit aktiven Oberflächenfunktionen in chemisch vernetzte Hydrogelnetzwerke eingebaut werden, um eine bessere Kontrolle über die Freisetzungsrate von RNAi-Therapeutika zu ermöglichen28. Die miRNA-beladenen Hydrogele fördern die Wundheilung, indem sie die Auflösung der Entzündungsphase auslösen. Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Makrophageninfiltration und eine wirksame lokale Polarisierung von Makrophagen in Richtung des M2-Phänotyps in vivo. Hydrogele unterstützen mit ihrer bemerkenswert hohen Wasseraufnahme die Zellanhaftung und das Zellwachstum und führen so zu einer besseren Wundheilung. Diese Hydrogel-Beispiele ergeben ein Spektrum unterschiedlicher zeitlicher Freisetzungsprofile für RNAi-Therapeutika, was besonders vorteilhaft ist, wenn man bedenkt, dass die Wundheilung aus einer sorgfältig orchestrierten Abfolge biologischer Ereignisse besteht.

Insbesondere besteht häufig das Risiko einer Infektion oder eines lokalen Traumas bei der Verwendung herkömmlicher Methoden zum Wundverschluss (z. B. Nähte). Daher kann die Verwendung von Klebstoffen auf Hydrogelbasis, die stark an der Wunde haften, als physikalische Barriere zum Schutz der Wunde vor den oben genannten Risiken eingesetzt werden, die die Reepithelisierung und die Heilungsrate stark beeinträchtigen94.

RNA-Moleküle haben bei der Immunmodulation große Aufmerksamkeit erhalten, vor allem aufgrund der RNA-Stummschaltung entscheidender Faktoren in Immunzellen95. Klebende Hydrogele wurden als immunmodulatorische Verbände verwendet. Für die kombinierte Abgabe von Chemolockstoffen für dendritische Zellen (DC) (MIP3a) und pDNA-siRNA-beladenen Mikropartikeln an Antigen-präsentierende Zellen wurde ein in situ vernetzbares und schnell abbaubares Hydrogel entwickelt96. DCs waren in der Lage, die Hydrogele zu infiltrieren und die Mikropartikel, die pDNA-siRNA trugen, effizient zu phagozytieren. Die Gele zogen im Vergleich zu einer äquivalenten Bolusdosis vier- bis sechsmal mehr DCs an. Eine neuere Studie zeigte, dass bei der In-vivo-Abgabe von mRNA-Lipoplexen, die in ein Chitosan-Alginat-Hydrogel geladen wurden, sowohl die T-Zell-Proliferation als auch die Interferon-γ-Sekretion zunahmen60. In Woche 1 wurde bei mit Lipoplex beladenen Hydrogelen eine humorale Reaktion beobachtet, während proteinbasierte Impfstoffe erst zwei Wochen nach der Injektion eine IgG-Produktion hervorriefen, was ihre Anwendung als praktikable Immunisierungsmethode gegen mehrere Krankheiten verstärkte.

Der Prozess der Angiogenese ist eng mit der Wundheilung und Geweberegeneration verbunden. Die Stimulierung sowohl der Bildung als auch der Reifung von Blutgefäßen ist daher von großem Interesse, insbesondere bei der Behandlung einiger chronischer Hautwunden. Die lokalisierte Stummschaltung allgegenwärtig exprimierter Gene (z. B. Mapk-1) in einem offenen Wundbett wurde mithilfe eines mit liposomaler siRNA97 beladenen Agarose-Hydrogels demonstriert. Die Abgabe von siRNA-NPs über Hydrogele, die Polyurethan (PUR) und seine Derivate Polyesterurethan (PEUR) oder Poly(thioketalurethan) (PTK-UR) enthalten, wurde ebenfalls für die Angiogenese untersucht98. Die Modulation der Freisetzungsrate führte zu Veränderungen im In-vivo-Stummschaltungsprofil. Die Stummschaltung des Prolylhydroxylase-Domänenproteins 2 (PHD2) führte zur Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors und des Fibroblasten-Wachstumsfaktors, während gleichzeitig das Gefäßvolumen und die Gefäßdicke innerhalb der Hydrogele ebenfalls zunahmen. Die Verwendung dieser Hydrogele für die lokale PHD2-siRNA-Abgabe erwies sich als vielversprechend für die Förderung der Angiogenese zur Wundheilung.

Einige andere gemeldete Anwendungen, wie z. B. Rückenmarksverletzungen, Fibrose und entzündliche Erkrankungen, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Makroskalige Verabreichungssysteme, die lokal in das erkrankte Gewebe implantiert werden können und gleichzeitig die mit der systemischen Verabreichung von RNA-Therapeutika verbundenen Komplikationen vermeiden, haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit von Forschern auf diesem Gebiet auf sich gezogen. Insbesondere können Hydrogele zur effizienten Abgabe sowohl kleiner als auch Makromoleküle wie Chemotherapeutika, Proteine ​​und genetischer Materialien (z. B. RNA) sowie nanopartikelbasierter Therapien eingesetzt werden. Hydrogele als dreidimensionales Matrixgerüst haben aufgrund ihrer Biokompatibilität, biologischen Abbaubarkeit, Fähigkeit zur Wirkstoffbeladung und kontrollierten Wirkstofffreisetzung in der Therapie an Bedeutung gewonnen. Im Vergleich zur systemischen Verabreichung bieten Hydrogelsysteme viele Vorteile, wie z. B. lokal kontrollierte RNA-Abgabe, niedrige RNA-Konzentration im Blut, hohe Permeabilität, wenige toxische Nebenwirkungen, Vermeidung des First-Pass-Leberstoffwechsels sowie minimale Schmerzen und Beschwerden70,75. Die Kombination einer lokalen Plattform zur Behandlung und Umschulung des Krankheitsgewebes mit der systemischen Verabreichung zur Behandlung einer bestehenden Nische einer entfernten Krankheit würde hochwirksame translationale Therapieplattformen mit verbesserten klinischen Ergebnissen ermöglichen81. Um dies auf die nächste Stufe zu heben, wurden kürzlich makroskalige Hydrogele mit Nano-/Mikro-Hydrogel-Bausteinen entwickelt99. Der hydrolytische Abbau makroskaliger Hydrogele ermöglichte dann die allmähliche Freisetzung von RNA-beladenen Nano-/Mikrohydrogelen, ohne dass nach der Behandlung restliches Biomaterial an der Krankheitsstelle zurückblieb. Das Gleichgewicht zwischen der Komplexität des Hydrogel-RNA-Designs, den Herstellungskosten, den Regulierungsrichtlinien und der effektiven Freisetzung in das Zielgewebe muss im Detail evaluiert werden, damit diese Strategien allgemein in klinischen Verfahren angewendet werden können.

Der Ort der Erkrankung und das Zielgewebe bestimmen die notwendigen physikalischen Eigenschaften des Hydrogels, während der Krankheitstyp das geeignete räumlich-zeitliche RNA-Freisetzungsprofil bestimmt. Injizierbare Hydrogele mit selbstheilenden Eigenschaften sind äußerst nützlich für die Verabreichung an das Herz, während topische Hydrogele mit Klebeeigenschaften für die RNA-Verabreichung an die Haut bevorzugt werden. Selbstheilende Hydrogele können beispielsweise den Scherkräften während der Injektion sowie den dynamischen Kräften standhalten, die durch die schlagenden Muskeln nach der Myokardinjektion erzeugt werden. Sollen Hydrogele auch als Gerüstmatrix zur Förderung der Geweberegeneration dienen, müssen weitere Parameter berücksichtigt werden. Dazu gehören Parameter wie die mechanische Robustheit und die Abbaurate der Hydrogele, die sich zwangsläufig auf die Freisetzungsrate eingekapselter RNA-Therapeutika auswirken können. Beispielsweise muss die RNA-Abgabe an verletztes Knochengewebe im Einklang mit der Heilungszeit (ca. 3–4 Wochen) erfolgen33. Abhängig von der Art der RNA und ihrer Verbindung mit einer bestimmten Heilungsphase kann die Lieferzeit daher zwischen mehreren Tagen und mehreren Monaten variieren100. Darüber hinaus können krankheitsbedingte Veränderungen der Mikroumgebung eines Gewebes, wie z. B. ein veränderter pH-Wert oder eine Hochregulierung bestimmter Enzyme, in das Hydrogel-Design implementiert werden, um die RNA-Freisetzung auszulösen.

Wie oben erwähnt, können biomedizinische Anwendungen der Hydrogel-vermittelten RNA-Verabreichung von der Geweberegeneration bis zur Krebstherapie reichen. Ein unerforschtes Gebiet ist jedoch der Einsatz von Hydrogelgerüsten zur Unterstützung der RNA-Zell-Interaktionen. Hier fungieren Hydrogele als Ausgangspunkt für die Genregulation und Gentechnik, da Zellen zur Interaktion mit RNAs in die Hydrogele wandern. Dieses Konzept wurde genutzt, um zuvor genmodifizierte menschliche mesenchymale Stromazellen in ein Kryogelgerüst zu integrieren101. Diese genetisch veränderten Zellen können bestimmte Antikörper freisetzen, die T-Zell-vermittelte Antitumorreaktionen auslösen können. Letztendlich könnten Hydrogelgerüste für RNA-Zell-Interaktionen einen kombinatorischen Effekt haben, indem sie gleichzeitig bestimmte Gene in den Zellen bearbeiten und deren Proliferation und Überleben unterstützen, wodurch die konstante Freisetzung wirksamer Antikörpermengen sichergestellt wird.

Eine weitere vielversprechende Anwendung von Hydrogelen in diesem Bereich ist die Verabreichung von RNA-Nano-Impfstoffen. Die Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wütet immer noch auf der ganzen Welt und Impfung ist die beste Verteidigung. Nach unermüdlichen Bemühungen sind nun zwei mRNA-Impfstoffe auf Basis von Lipid-NPs (BNT162b2 von Pfizer/BioNTech und mRNA-1273 von Moderna) im klinischen Einsatz. Injizierbare Hydrogele wurden kürzlich zur lokalen Verabreichung von polymeren Nanoimpfstoffen gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (enthaltend das SARS-CoV-2-Virus-Spike-Protein mit/ohne Adjuvans) in Tiermodellen verwendet102. Interessanterweise zeigen die Ergebnisse, dass die anhaltende Abgabe der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spike-Protein-Nanoimpfstoffs in einer injizierbaren Hydrogel-Depotformulierung höhere Gesamt-Anti-RBD-IgG-Titer im Vergleich zu Bolusimpfstoffkontrollen erzielte. Ein ähnliches Konzept kann auf aktuelle SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe angewendet werden, indem diese in Hydrogele eingebaut werden. Derzeit sind für diese mRNA-Nano-Impfstoffe zwei Dosen im Abstand von 3–4 Wochen erforderlich. Durch die Verwendung von Hydrogelkapseln mit pulsierender Freisetzung könnten die Impfstoffe über die Wochen 3 bis 4 in Impulsen freigesetzt werden, was bei Injektion zusammen mit kostenlosen Nano-Impfstoffen zu einer Einmalimpfung führen könnte103. Es sollte jedoch auch beachtet werden, dass bisher wenig getan wurde, um die In-vivo-Stabilität von mRNA in Hydrogelen unter physiologischen Bedingungen über einen so langen Zeitraum zu untersuchen, was ein wichtiger Bereich für zukünftige Studien sein wird. Tatsächlich löst eine suboptimale Stabilität bei größeren RNAs wie mRNA nur eine kurzfristige vorübergehende Proteinexpression aus und erfordert Transportvehikel wie NPs, um sie vor enzymatischem Abbau zu schützen und ihre Transfektionseffizienz zu verbessern. Über die Verwendung von Hydrogelen zur nackten mRNA-Abgabe wurde selten berichtet. Daher wird für zukünftige Bemühungen, große RNAs zu modifizieren, um Stabilität und Transfektion zu verbessern, die Anwendung von Hydrogelen für die Abgabe nackter RNA fruchtbarer sein. Ein weiteres Problem bei mRNA-Nano-Impfstoffen besteht darin, dass sie bei niedrigen Temperaturen gelagert und versendet werden müssen. Angesichts der derzeit dürftigen Evidenz wird es wichtig sein, Hydrogele zu identifizieren, die für die langfristige mRNA-Lagerung bei 4 °C oder sogar Raumtemperatur geeignet sind. Mit weiteren Forschungsarbeiten könnte die Hydrogel-vermittelte mRNA-Impfstoffabgabe eine praktikable Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure-Immunisierungsmethoden werden.

In diesem Aufsatz haben wir die Verwendung von Hydrogelen als RNA-Abgabesysteme vom Design bis zu biomedizinischen Anwendungen diskutiert. Die hier besprochene Forschung zeigt, dass Hydrogelsysteme nicht nur in der Lage sind, RNA nachhaltig lokal abzugeben (wodurch eine wiederholte Verabreichung vermieden wird), sondern auch die Freisetzungsrate räumlich und zeitlich zu steuern. Weitere In-vivo-Untersuchungen der Eigenschaften RNA-beladener Hydrogele wie Abbaubarkeit, Clearance, kontrollierte Freisetzung und Fremdkörperreaktion sind dringend erforderlich. Es wird erwartet, dass kontinuierliche Verbesserungen im Design und der Herstellung von Hydrogelen diese spannenden Materialien immer näher an klinische Anwendungen der RNA-Therapie bringen werden.

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Diese Arbeit wurde durch die US National Institutes of Health Grants R01CA200900, R01HL156362, R01HL159012 und R01HL162367 (an JS), den Lung Cancer Discovery Award der American Lung Association (an JS), den Innovation Discovery Grants Award des Mass General Brigham ( an JS), den European Research Council Starting Grant (ERC-StG-2019-848325 an JC und BBM) und den Fundação para a Ciência ea Tecnologia FCT Grant (PTDC/BTM-MAT/4738/2020 an JC).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ruibo Zhong, Sepehr Talebian, Bárbara B. Mendes.

Zentrum für Nanomedizin und Abteilung für Anästhesiologie, perioperative Medizin und Schmerzmedizin, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Ruibo Zhong & Jinjun Shi

Fakultät für Ingenieurwissenschaften, School of Chemical and Biomolecular Engineering, The University of Sydney, Sydney, New South Wales, Australien

Sepehr Talebian

Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney, Sydney, New South Wales, Australien

Sepehr Talebian

ToxOmics, Fakultät für Medizinische Wissenschaften der NOVA Medical School, NMS FCM, NOVA-Universität Lissabon, Lissabon, Portugal

Bárbara B. Mendes & João Conde

ARC Centre of Excellence for Electromaterials Science, Intelligent Polymer Research Institute, AIIM, Innovation Campus, University of Wollongong, North Wollongong, New South Wales, Australien

Gordon Wallace

Koch-Institut für integrative Krebsforschung, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Robert Langer

Abteilung für Chemieingenieurwesen, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Robert Langer

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Korrespondenz mit João Conde oder Jinjun Shi.

RL erklärt die folgenden finanziellen Interessen: Alnylam Pharmaceuticals, Inc. und Moderna, Inc. Eine Liste der Unternehmen, an denen RL beteiligt ist, ob entschädigt oder nicht entschädigt, finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung. JC ist Mitbegründer und Anteilseigner von TargTex SA – Targeted Therapeutics for Glioblastoma Multiforme. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Materials dankt Tatiana Segura, Millicent Sullivan und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Finanzielle Interessen.

Springer Nature oder sein Lizenzgeber (z. B. eine Gesellschaft oder ein anderer Partner) besitzen die ausschließlichen Rechte an diesem Artikel im Rahmen einer Veröffentlichungsvereinbarung mit dem Autor bzw. den Autoren oder anderen Rechteinhabern. Die Selbstarchivierung der akzeptierten Manuskriptversion dieses Artikels durch den Autor unterliegt ausschließlich den Bedingungen dieser Veröffentlichungsvereinbarung und geltendem Recht.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhong, R., Talebian, S., Mendes, BB et al. Hydrogele für die RNA-Lieferung. Nat. Mater. (2023). https://doi.org/10.1038/s41563-023-01472-w

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Eingegangen: 06. Januar 2021

Angenommen: 09. Januar 2023

Veröffentlicht: 20. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41563-023-01472-w

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