Die biochemische Charakterisierung der Polyphenoloxidase aus Dimocarpus longan liefert Einblicke in ihre katalytische Effizienz

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 20322 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die vom tropischen Longanbaum produzierten „Drachenaugen“-Früchte sind reich an Nährstoffen und Antioxidantien. Sie leiden unter einer enzymatischen Bräunung nach der Ernte, einem Prozess, für den hauptsächlich die Enzymfamilie der Polyphenoloxidasen (PPO) verantwortlich ist. In dieser Studie wurden zwei für PPO kodierende cDNAs aus Blättern von Dimocarpus longan (Dl) kloniert, heterolog in Escherichia coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Das Präpro-DlPPO1 enthält an seinem N-terminalen Ende zwei Signalpeptide, die den Transport des Proteins in das Chloroplastenstroma und zum Thylakoidlumen erleichtern. Die Entfernung der beiden Signalpeptide aus Präpro-DlPPO1 ergibt Pro-DlPPO1. Das Präpro-DlPPO1 zeigte eine höhere thermische Toleranz als Pro-DlPPO1 (Entfaltung bei 65 °C gegenüber 40 °C), was darauf hindeutet, dass das Signalpeptid die Faltung von DlPPO1 stabilisieren könnte. DlPPO1 kann als Tyrosinase klassifiziert werden, da es sowohl monophenolische als auch diphenolische Substrate akzeptiert. Das Pro-DlPPO1 zeigte die höchste Spezifität gegenüber dem natürlichen Diphenol (–)-Epicatechin (kcat/KM von 800 ± 120 s−1 mM−1), was höher ist als für 4-Methylcatechol (590 ± 99 s−1 mM−). 1), Pyrogallol (70 ± 9,7 s−1 mM−1) und Kaffeesäure (4,3 ± 0,72 s−1 mM−1). Die kinetischen Effizienzen von prepro-DlPPO1 sind 23-, 36-, 1,7- bzw. 4,7-fach niedriger als die, die mit pro-DlPPO1 für die vier oben genannten diphenolischen Substrate beobachtet wurden. Darüber hinaus zeigten Docking-Studien, dass (–)-Epicatechin eine niedrigere Bindungsenergie aufweist als jedes andere untersuchte Substrat. Sowohl kinetische als auch in-silico-Studien deuten stark darauf hin, dass (–)-Epicatechin ein gutes Substrat von DlPPO1 ist, und stellen die Affinität von PPOs gegenüber bestimmten Flavonoidverbindungen fest.

Polyphenoloxidasen (PPOs) sind Dikupfer-Metalloenzyme vom Typ III, die in Bakterien1, Pilzen2,3, Archaeen4, Pflanzen5, Insekten6,7 und Tieren einschließlich Menschen8,9 vorkommen. Die PPO-Familie enthält Tyrosinasen (TYRs)10,11,12,13 und Catecholoxidasen (COs)14,15. TYRs katalysieren die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen zu o-Diphenolen (Monophenolase-Aktivität, EC 1.14.18.1) und anschließend die Oxidation der entsprechenden o-Diphenole zu o-Chinonen (Diphenolase-Aktivität, EC 1.10.3.1), wohingegen COs nur leistungsfähig sind die letztere Diphenolaseaktivität13,16. Die resultierenden Chinone sind hochreaktive Verbindungen und polymerisieren schnell, nicht enzymatisch, wodurch gelbe bis schwarze komplexe Pigmente entstehen, die als Melanine bekannt sind17,18.

In vivo werden pflanzliche PPOs als Vorläuferprotein (Präpro-PPO) translatiert, was der Translation von ~ 600 Aminosäuren mit etwa 60–75 kDa19,20 entspricht. Ein Prepro-PPO enthält drei verschiedene Domänen; eine N-terminale Signalsequenz, die katalytisch aktive Domäne, die die Cu-Cu-Stelle beherbergt, und eine C-terminale Domäne, die die aktive Domäne abschirmt5,20,21 (Abbildung S1). Die Signalsequenz (~ 80–100 Aminosäuren) leitet das Protein zu seinem subzellulären Ziel, während es selbst abgespalten wird22,23. Nach der Translokation durch die Thylakoidmembran wird das verbleibende Passagierprotein zu einer latenten Form (Pro-Form) verarbeitet, die im Allgemeinen 45–69 kDa groß ist14. Das zweikernige Kupferzentrum, in dem jedes Kupfer einzeln durch drei in der aktiven Domäne befindliche Histidinreste17,24 koordiniert wird, bleibt durch die C-terminale Domäne abgeschirmt und verhindert so wirksam, dass das aktive Zentrum den Kandidatensubstraten ausgesetzt wird. Die Latenz wird erhöht, wenn die C-terminale Domäne vom aktiven Zentrum getrennt wird. In vitro kann die Störung durch Proteasen (z. B. Trypsin, Proteinase K)25, sauren oder basischen pH-Wert24, Fettsäuren26 und künstliche Detergenzien (z. B. Natriumdodecylsulfat, SDS)17,27,28,29,30,31 beeinflusst werden. 32,33. Obwohl der natürliche proteolytische Mechanismus unbekannt ist17, wurde kürzlich berichtet, dass pflanzliche PPOs zur Selbstaktivierung fähig sind, die das aktive Enzym autoproteolytisch von der C-terminalen Domäne trennen kann34,35,36.

Longan (Dimocarpus longan, Dl) gehört zur Familie der Seifenbaumgewächse (Sapindaceae) und stammt aus der subtropischen Region Südostasien37,38. Die Frucht ist mit mehreren Nährstoffen angereichert, insbesondere die Fruchtwand enthält große Mengen an phenolischen Verbindungen39,40,41 wie (–)-Epicatechin, 4-Methylcatechol, Pyrogallol, Kaffeesäure, Gallussäure, Quercetin, Vanillinsäure und Ferulasäure ( Abbildung S2), die starke entzündungshemmende, antioxidative und krebsbekämpfende Aktivitäten aufweisen42,43. Trotz der gesundheitlichen Vorteile, die sich aus den Phenolverbindungen ergeben, kann Longan-Perikarp bei Umgebungstemperatur schnell verderben und zwei bis drei Tage nach der Ernte eine braune Farbe entwickeln44. Durch die entstehenden braunen Komplexe wird die Qualität der Früchte erheblich beeinträchtigt. Um die Lagerfähigkeit von Longan zu verlängern, wurden physikalische Ansätze wie Fungizidtauchen, Wachs, Chitosanbeschichtung und Schwefelbegasung angewendet45,46,47,48,49; Allerdings ist die Bräunungsreaktion nach wie vor das Hauptproblem der Longan-Industrie47. Obwohl PPOs umfassend als Hauptursache für die Bräunung nach der Ernte in vielen landwirtschaftlichen Produkten untersucht wurden11,12,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61 gibt es nur wenige Berichte dazu verfügbar zu den biochemischen Eigenschaften von Longan PPO62,63,64. Das Enzym wurde aus der natürlichen Quelle extrahiert und durch Ammoniumsulfatfällung und anschließende Säulenchromatographie (Sephadex G-200 und Phenylsepharose) oder Dialyse62,63 gereinigt. Der optimale pH-Wert und die optimale Temperatur für das extrahierte Longan-PPO liegen Berichten zufolge bei 6,5 bzw. 35 °C62. Das Enzym war gegenüber Pyrogallol, 4-Methylcatechol und Catechol aktiv. In einem weiteren Bericht wurde auch (–)-Epicatechin als optimales endogenes Substrat für Longan beschrieben63. Ein Longan-PPO-Gen wurde ebenfalls geklont64, wurde jedoch nicht heterolog exprimiert. Die Enzymklassifizierung der Longan-PPOs bleibt unbekannt und ihre Spezifität und kinetische Effizienz gegenüber phenolischen Substraten wurden bisher nicht gut untersucht.

Hier wurden zwei cDNAs, die PPO-Gene enthalten, aus Blättern von Dimocarpus longan kloniert. Das Pro-DlPPO1 kodiert eine latente Form, während das Präpro-DlPPO1 einen Vorläufer der latenten Form kodiert, der zusätzlich eine N-terminale Signalsequenz in seiner Proteinsequenz enthält. Diese Signalsequenz besteht aus einem Transitpeptid, das den Transport in das Chloroplastenstroma erleichtert, und einem Thylakoid-Transfersignal, das das Thylakoidlumen als endgültigen Bestimmungsort des Proteins bestimmt65. Normalerweise werden pflanzliche Signalpeptide von Bakterien nicht erkannt. Obwohl die gesamte Sequenz in ein Protein übersetzt wird, kann die Tatsache, dass die Signalpeptide von Bakterien nicht richtig verarbeitet werden können, dazu führen, dass das gesamte Protein während der Expression aggregiert. In dieser Arbeit wurde erstmals ein Präpro-PPO erfolgreich in einem prokaryotischen System exprimiert, bis zur Homogenität gereinigt und im Vergleich zum analogen Pro-Enzym biochemisch analysiert. Die kinetischen Eigenschaften beider Varianten gegenüber phenolischen Substraten wurden bewertet. Die kinetisch charakterisierten Substrate wurden in zwei Gruppen eingeteilt: natürliche Substrate ((–)-Epicatechin, 4-Methylcatechol, Kaffeesäure und Pyrogallol) (Abbildung S2) und Standardsubstrate (Tyramin, Tyrosin, Dopamin und l-DOPA) (Abbildung S3). . Natürliche Substrate beziehen sich auf phenolische Verbindungen, die zuvor in Longan-Extrakten durch HPLC39,40,41 nachgewiesen wurden, während Standardsubstrate diejenigen sind, die üblicherweise zur Charakterisierung von PPOs3,17,66,67,68 verwendet werden (die in Longan-Früchten vorhanden sein können oder nicht). Darüber hinaus wurden Docking-Studien unter Verwendung einer Modellstruktur von DlPPO1 durchgeführt, um die Enzym-Substrat-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die biochemischen Auswirkungen des Vorhandenseins seiner Signalsequenz auf DlPPO1 aufzuklären und sollte die grundlegenden Informationen über die Substratakzeptanz und -spezifität von DlPPO1 liefern, die für die Entwicklung neuer nachhaltiger Methoden zur Verbesserung der Bräunung dieses DlPPO1 nach der Ernte erforderlich sind kommerziell wichtige tropische Frucht.

Die PCR-Produkte auf der komplementären DNA von D. longan mit Primern, die den ORF für prepro-DlPPO1 und pro-DlPPO1 umrahmen, ergaben deutliche Banden von etwa 1800 bp bzw. 1500 bp (Abbildung S4). Nach der Klonierung in den pGEX-6P-SG-Vektor69 bestätigte die Sanger-Sequenzierung, dass das Präpro-DlPPO1 aus einem ORF von 1797 Nukleotiden besteht und für 599 Aminosäuren kodiert, die zu 100 % mit der aus dem veröffentlichten DlPPO1 abgeleiteten Aminosäuresequenz identisch sind ( Uniprot-Eintrag: A0A0K0NPU9)64. Das pro-DlPPO1 enthält einen ORF von 1512 Nukleotiden, der 503 Aminosäuren kodiert (Tabelle S1) und weist eine Identität von 99,60 % mit der zuvor veröffentlichten DlPPO1-Sequenz64 auf, die sich aus fünf veränderten Aminosäuren (Pro46Arg, Glu226Asp, Gln451His, Ile455Met und Asn486Tyr, Abbildung S5) ergibt. . Die Enzyme pro-DlPPO1 und prepro-DlPPO1 wurden heterolog in E. coli mit einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase-Tag aus Schistosoma japonicum69 exprimiert (siehe Materialien und Methoden). Die Temperaturen bei der Induktion von Isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) während der Expression wurden variiert (37 °C, 28 °C und 17,5 °C), um Bedingungen zu untersuchen, die für eine hohe Produktion von löslichem Protein günstig sind. Abbildung S6 zeigt, dass die effizienteste Expressionstemperatur sowohl für Pro-DlPPO1 als auch für Präpro-DlPPO1 bei 17,5 °C lag, während 37 °C zum niedrigsten Expressionsniveau sowohl der löslichen als auch der nichtlöslichen Formen führte. Über eine wirksame Produktion löslicher PPO-Enzyme bei Expression bei niedrigen Temperaturen wurde auch für TYRs aus Juglans regia (20 °C)67, Agaricus bisporus (20 °C)3, Solanum lycopersicum (20 °C)17 und Malus Domestica (20 °C) berichtet. 66, Streptomyces avermitilis (18 °C)70, Streptomyces sp. ZL-24 (19 °C)68 und Larrea tridentata (25 °C)32.

Es wurde berichtet, dass die C-terminale Domäne eukaryotischer PPOs für die Faltung der katalytischen Domäne71 notwendig ist. Bisher ist die Expression von aktivem Trauben-PPO72 das einzige Beispiel für die erfolgreiche Produktion eines Pflanzen-PPO ohne seine C-terminale Domäne.

Durch die Reinigung durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der Affinität von auf vernetzter Agarose immobilisiertem Glutathion ergaben die Expressionen 35,3 bzw. 60,0 mg pro Liter Expressionskultur an GST-fusioniertem Pro-DlPPO1 bzw. GST-fusioniertem Präpro-DlPPO1 (Abbildung S7). . Die Entfernung des GST-Fusions-Tags durch die HRV3C-Protease führte zu 5,7 bzw. 7,0 mg latentem Pro-DlPPO1 bzw. Präpro-DlPPO1 (Tabelle 1). Das Präpro-DlPPO1 wurde erfolgreich mit einer Wiedergewinnung der Gesamtproteinaktivität von 13,5 % und einer spezifischen Aktivität von 7,09 ± 0,05 U mg-1 gereinigt, während das Pro-DlPPO1 mit einer Rückgewinnung der Gesamtproteinaktivität von 19,6 % und einer spezifischen Aktivität von 1,0 % zurückgewonnen wurde 28,3 ± 0,04 U mg−1. Der Kupfergehalt der DlPPO1-Varianten wurde photometrisch gemessen, indem Cu(II) mit Ascorbat zu Cu(I) reduziert und die Komplexierung von Cu(I) mit 2,2′-Bichinolin bei 546 nm73 verfolgt wurde. Es wurde beobachtet, dass der Kupfergehalt von pro-DlPPO1 und prepro-DlPPO1 1,3 ± 0,018 bzw. 2,0 ± 0,030 Kupferionen pro aktivem Zentrum betrug. Die frisch gereinigten Proteine ​​eluierten in 50 mM Tris-HCl und 250 mM NaCl bei pH 7,5 und wurden sofort gegen 100 mM MES und 200 mM NaCl bei pH 6,5 ausgetauscht, und zur Lagerung beider wurde Glycerin mit 30 % (v/v) aufgetragen Formiert sich bis zur Verwendung bei − 80 °C. Die Reinheit der endgültigen Pro-DlPPO1- und Präpro-DlPPO1-Präparate wurde durch SDS-PAGE bestätigt (Abb. 1 und Abbildung S8 für die Gele voller Länge).

SDS-PAGE von pro-DlPPO1 (links) und präpro-DlPPO1 (rechts) in verschiedenen Reinigungsstadien. (A) unlösliche Fraktion der Bakterienzellpellets, (B) insgesamt lösliche Proteine, C) GST-DlPPO1, das eluierte GST-Fusionsprotein nach der Glutathion-Affinitätschromatographie (erster Reinigungsschritt auf ÄKTA FPLC), (D) Fraktionen von Proteinen, nachdem GST-DlPPO1 durch HRV3C-Protease geschnitten wurde, und E) endgültiges DlPPO1-Produkt (markiert mit einem roten Rahmen; siehe Tabelle 2) aus der zweiten Runde der Glutathion-Affinitätschromatographie. Die erste Spur jedes Gels ist der Molekulargewichtsmarker. Die vollständigen Gele sind in Abbildung S8 dargestellt.

Die Gelelektrophorese zeigte eine markante Bande des endgültigen gereinigten Pro-DlPPO1 und Präpro-DlPPO1 bei etwa ~ 57 kDa bzw. ~ 67 kDa, was darauf hindeutet, dass es sich um latente (Pro-DlPPO1) und Vorläuferformen (Präpro-DlPPO1) von Longan-PPO1 handelte erhalten. Die theoretischen Massen von pro-DlPPO1 und prepro-DlPPO1 wurden aus der Summenformel des jeweiligen Proteins unter Verwendung des Atomgewichts und der Isotopenzusammensetzung der konstituierenden Elemente74 unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von zwei konservierten Disulfidbindungen (− 4H oder − 4,032 Da) und einer Thioetherbrücke berechnet (− 2H oder − 2,016 Da), wie in Tabelle 2 gezeigt. Um die tatsächlichen Molekulargewichte der Enzym-Elektrospray-Ionisation zu bestätigen, wurde Massenspektrometrie (ESI-MS) angewendet. Das pro-DlPPO1 ergab 56.845 Da (Abb. 2), was in hervorragender Übereinstimmung mit der berechneten Masse des Proteins ist, beginnend mit dem vom Vektor abgeleiteten GlyProMet (in Abbildung S5 als − 3, − 2, − 1 markiert) bis zum Ende der latenten PPO-Sequenz (Ala 1 → Asp 503). Dies bestätigt, dass pro-DlPPO1 als latente PPO-Form mit zwei Disulfidbindungen und einer Thioetherbrücke exprimiert wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass präpro-DlPPO1 eine Masse von 67.285 Da hat und außerdem eine Thioetherbrücke und zwei Disulfidbindungen enthält (Abb. 2). Die Masse stimmt perfekt mit der vollständigen Sequenz des Präpro-Polypeptids (Met 1 → Asp 599) plus den drei Aminosäuren GlyProMet (− 3, − 2, − 1) überein, die aus dem Expressionsvektor stammen.

ESI-MS des Vorläufer-Präpro-DlPPO1 und des latenten Pro-DlPPO1. Die gesamten Massenspektren von (A) pro-DlPPO1 und (B) prepro-DlPPO1 werden gezeigt, während der Einschub die vergrößerte Ansicht der beiden prominentesten Ladungsstufen darstellt. Die berechneten und gemessenen Massen der beiden Zustände des Enzyms sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Der thermische Verschiebungstest wurde verwendet, um die thermische Stabilität rekombinanter Proteine ​​zu bewerten8,17,75. Hier wurde die thermische Stabilität der gereinigten Pro-DlPPO1- und Präpro-DlPPO1-Proteine ​​bei pH 6,5 (Lagerpufferbedingung) getestet. Wie in Abb. 3 dargestellt, wurden für prepro-DlPPO1 zwei Schmelztemperaturen (Tm) bei 69,5 °C und 77,5 °C gemessen, während pro-DlPPO1 drei Tm-Werte aufwies (54,5 °C, 70,5 °C und 81,5 °C). bis zur vollständigen Denaturierung der Enzyme. Die Entfaltung von pro-DlPPO1 begann bei einer viel niedrigeren Temperatur (~ 40 °C) (Abb. 3, Abbildung S9) als für präpro-DlPPO1 (~ 65 °C). Die resultierende erste Tm von pro-DlPPO1 ist viel niedriger als die anderen Tm-Werte, die für beide Varianten des Enzyms beobachtet wurden. Dies weist stark darauf hin, dass das latente Pro-DlPPO1 bei deutlich niedrigeren Temperaturen einen gewissen Grad an eingeschränkter Entfaltung aufweist als sein Vorläufer Präpro-DlPPO1. Da das Pro-DlPPO1 nur Domänen enthält, die auch im Präpro-DlPPO1 vorhanden sind, scheint es, dass der Einschluss der Signalpeptide tatsächlich die gesamte thermische Stabilität von DlPPO1 erhöht und die Signalpeptide zur Aufrechterhaltung der Proteinstabilität beitragen.

Thermische Stabilität der DlPPO1-Varianten durch thermische Verschiebungstests. Die Schmelztemperaturwerte (Tm) wurden aus der Ableitung der Fluoreszenzintensität (I, in willkürlichen Einheiten) in Bezug auf den Temperaturanstieg bestimmt. Das Präpro-DlPPO1 (blaue Linie) führte zu Tm-Werten von 69,5 °C und 77,5 °C. Das pro-DlPPO1 führte zu Tm-Werten von 54,5 °C, 70,5 °C und 81,5 °C. Die rohen Fluoreszenzintensitäten sind in Abbildung S9 dargestellt.

Die Aktivierung von pro-DlPPO1 wurde über die Umwandlung von Tyramin überwacht (Abbildung S3), um die richtige SDS-Konzentration zur Überwindung der Latenz des Enzyms zu überprüfen. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 0,5 µg pro-DlPPO1 und 8 mM Tyramin als Substrat in 50 mM MES bei pH 7,0 mit verschiedenen SDS-Konzentrationen (0 bis 1,5 mM) untersucht. Wie in Abbildung S10 dargestellt, führte ein Anstieg der SDS-Konzentration von 0,00 auf 0,25 mM zu einer deutlichen Steigerung der pro-DlPPO1-Aktivität, wobei die höchste Aktivierungseffizienz bei 0,25 mM SDS (28,3 ± 0,04 U mg−1) erreicht wurde. Bei höheren SDS-Konzentrationen nahm die enzymatische Aktivität allmählich ab. Der Aktivitätsverlust um die Hälfte des Optimums wurde bei einer SDS-Konzentration von 1,25 mM beobachtet. Daher wurde die optimale SDS-Konzentration für die Aktivierung von pro-DlPPO1 auf 0,25 mM festgelegt und diese Menge an zugesetztem Aktivator wurde in allen nachfolgenden Experimenten angewendet. Für prepro-DlPPO1 wurde ein qualitativ identisches Aktivierungsverhalten beobachtet (Abbildung S10).

Die meisten Enzyme verlieren ihre biologischen Aktivitäten bei der Behandlung mit SDS, während PPOs bis zu einem gewissen Grad resistent gegen SDS sind, was wahrscheinlich teilweise auf das Vorhandensein von Disulfidbindungen in der Struktur zurückzuführen ist55,76,77. SDS initiiert die Aktivierung von PPOs durch die Einführung von Konformationsänderungen der N- und C-Termini der latenten Form, die die Freilegung des aktiven Zentrums ermöglichen und den Substratzugang fördern78. Die PPO-Aktivierung wird im Allgemeinen bei niedrigen SDS-Konzentrationen erreicht, während höhere Konzentrationen des anionischen Detergens die enzymatische Aktivität deutlich hemmen79,80, was mit dem für DlPPO1 beobachteten SDS-Aktivierungsprofil übereinstimmt. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von SDS zur Aktivierung latenter PPOs die beste Aktivierungsmethode in vitro ist, da sie die Latenz pflanzlicher PPOs fast vollständig eliminiert und eine Aktivität bereitstellt, die reifem PPO sehr ähnlich ist (nach der Entfernung der C-terminalen Domäne). 66. Der Grad der SDS-Aktivierung variiert stark bei Pflanzenextrakten78; Beispielsweise waren 0,13 mM SDS erforderlich, um latentes Kartoffel-PPO (Solanum tuberosum)33, 0,35 mM SDS für Pilz-PPO (Agaricus bisporus)81, 0,69 mM SDS für Tafelrüben-PPO (Beta vulgaris)82 und 2 mM SDS für Pfirsich-PPO zu aktivieren (Prunus persica cv. Paraguaya)83 und 6,93 mM SDS für Mango-PPO (Mangifera indica)84. Es hat sich gezeigt, dass die erforderliche Detergenskonzentration zur Aktivierung von Löwenzahn-PPO hauptsächlich von den Aminosäuren bestimmt wird, die die Schnittstelle zwischen der katalytischen und der C-terminalen Domäne bilden85. Die Verwendung von 0,25 mM SDS für die pro-DlPPO1-Aktivierung liegt im Vergleich zu anderen heterolog exprimierten PPOs wie Walnuss-JPPO1 (2 mM SDS)67, Tomaten-SlPPO1 und SlPPO2 (1,5 mM SDS)17 und Pilz-AbPPO4 (2) am unteren Ende mM SDS)3 und für Apfel MdPPO1 (3 mM), MdPPO2 (2 mM) und MdPPO3 (4 mM)66.

Der pH-Wert ist einer der Parameter, die die Aktivität eines PPO beeinflussen86. Um den pH-Wert des Reaktionspuffers für die Pro-DlPPO1-Aktivität zu optimieren, wurde die Enzymreaktion mit 50 mM MES- und TRIS-Puffer im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 unter Verwendung von 0,5 µg Pro-DlPPO1, 8 mM Tyramin als Substrat und 0,25 mM SDS untersucht zur Aktivierung des Enzyms. Abbildung S11 zeigt, dass das Enzym in diesem pH-Bereich unterschiedliche Aktivitätsgrade aufweist. Die höchste Aktivität wurde bei pH 7,0 (28,3 ± 0,04 U mg-1) in MES-Puffer gezeigt, während die Aktivität bei pH 6,5 leicht um 17 % abnahm und bei pH 6,0 und 5,5 deutlich um 61 % bzw. 86 % reduziert wurde. Ebenso nahm die Aktivität bei höherem pH-Wert (pH 7,5–8,5) deutlich ab. Bei pH 7,5 wurde eine Abnahme um 43 % und bei pH 8,0 um 74 % beobachtet. Die Aktivität war bei pH 8,5 nahezu erschöpft, mit einem Aktivitätsverlust von 96 % gegenüber dem Optimum. Für die Tyrosinasen in Äpfeln (MdPPO1 und MdPPO3)66 und Pilzen (AbPPO4)3 wurde bereits über ein pH-Optimum von 7,0 berichtet. Bei MdPPO366 wurde ein etwas höherer optimaler pH-Wert von 7,5 beobachtet. JrPPO1 und JrPPO2 aus Walnuss hatten niedrigere pH-Optima von pH 6,067, wohingegen die bakterielle Tyrosinase aus Streptomyces sp. aus Torfland (SzTYR) ergab aufgrund der Anpassung an die natürliche pH-Umgebung ein ungewöhnlich hohes pH-Optimum von pH 9,068.

Die katalytische Leistung von pro-DlPPO1 wurde zunächst unter Verwendung von vier Standardsubstraten untersucht (Abbildung S3): Zwei Monophenole (Tyramin, D- und L-Tyrosin) und zwei Diphenole (Dopamin und L-DOPA) wurden beim optimalen pH-Wert des Enzyms von 7,0 angewendet und eine SDS-Konzentration von 0,25 mM. Das pro-DlPPO1 akzeptiert alle vier Standardsubstrate aus den Kategorien Monophenol und Diphenol und kann daher als TYR (EC 1.14.18.1) klassifiziert werden. KM- und kcat-Werte wurden durch nichtlineare Regression berechnet und die Substratspezifität wurde anhand des kcat/KM-Verhältnisses geschätzt. Daten zur Substratspezifität für pro-DlPPO1 sind in Tabelle 3 und Abbildung S13 dargestellt. Das diphenolische Substrat Dopamin wird schneller verarbeitet (kcat: 260 ± 22 s−1) als L-DOPA (kcat: 98 ± 8,5 s−1) und das Monophenol-Tyramin (kcat: 35 ± 1,9 s−1) wird schneller hydroxyliert l- oder d-Tyrosin. Darüber hinaus weist pro-DlPPO1 einen niedrigeren KM-Wert für Dopamin auf (KM: 2,0 ± 0,35 mM), was zu der höchsten katalytischen Effizienz (kcat/KM) unter den vier getesteten Standardsubstraten führt. Das kcat/KM-Verhältnis für Dopamin ist 4,6-, 16-, 336- und 504-fach höher als das von l-DOPA (28 ± 3,9 s−1 mM−1) und Tyramin (8,2 ± 0,91 s−1 mM−1). ), d-Tyrosin (0,39 ± 0,016 s−1 mM−1) bzw. L-Tyrosin (0,26 ± 0,016 s−1 mM−1) (Tabelle 3). Das Präpro-DlPPO1 akzeptiert auch sowohl Standardmonophenole (Tyramin und Tyrosin) als auch Diphenole (Dopamin und l-DOPA), jedoch mit unterschiedlichem Grad an katalytischer Effizienz (Tabelle 3 und Abbildung S14). Das Präpro-DlPPO1 bindet Dopamin mit einem ähnlichen KM-Wert (KM: 2,3 ± 0,27 mM) wie der für die Pro-Form beobachtete Wert (KM: 2,0 ± 0,35 mM); Allerdings ist die katalytische Effizienz von Präpro-DlPPO1 im Vergleich zu Pro-DlPPO1 um das 7,5-fache reduziert, mit einem kcat/KM von 17 ± 2,4 s−1 mM−1. Die Umwandlung des Diphenol-l-DOPA durch prepro-DlPPO1 (kcat/KM von 12 ± 1,1 s−1 mM−1) war aufgrund der geringeren katalytischen Aktivität (kcat: 40 ± 2,1 s−1) im Vergleich zu 2,4-fach langsamer pro-DlPPO1. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die monophenolischen Substrate beobachtet: Die Hydroxylierung von Tyramin (kcat/KM von 1,6 ± 0,14 s−1 mM−1) durch prepro-DlPPO1 ist 5,2-fach weniger effizient als für pro-DlPPO1 bei gleichzeitigem Anstieg von KM auf 15 ± 1,0 mM und eine verringerte katalytische Aktivität (kcat: 24 ± 1,4 s−1). Die kinetische Untersuchung der Monophenole L- und D-Tyrosin ergab verringerte kcat/KM-Verhältnisse, die 1,3- und 1,6-fach niedriger sind als die für Pro-DlPPO beobachteten Werte.

Um Einblicke in das kinetische Verhalten von DlPPO1 in seiner natürlichen Umgebung zu gewinnen, wurde eine Reihe natürlicher phenolischer Substrate ((–)-Epicatechin, 4-Methylcatechol, Kaffeesäure, Pyrogallol, Gallussäure, Quercetin, Vanillinsäure und Ferulasäure) verwendet (Abbildung S2). ), die alle in der Schale, dem Fruchtfleisch und den Samen von Longan nachgewiesen wurden39,40,41, wurden bewertet. Daten zur natürlichen Substratspezifität von pro-DlPPO1 sind in Tabelle 3 und Abbildung S15 dargestellt. Durch die kinetischen Studien wurde gezeigt, dass pro-DlPPO1 gegenüber den Polyphenolen (–)-Epicatechin, 4-Methylcatechin, Kaffeesäure und Pyrogallol aktiv ist, während das Enzym gegenüber den übrigen getesteten Substraten völlig inaktiv war. Die höchste Effizienz von pro-DlPPO1 wurde gegenüber (–)-Epicatechin (kcat: 270 ± 15 s−1) mit einem KM von 0,35 ± 0,052 mM beobachtet, was zu einem kcat/KM von 800 ± 120 s−1 mM−1 führte. Diese Hinweise legen nahe, dass (–)-Epicatechin höchstwahrscheinlich eines der physiologischen Substrate von DlPPO1 in Longan ist. Die Umwandlungsraten von 4-Methylcatechol, Pyrogallol und Kaffeesäure waren niedriger als für (–)-Epicatechin mit resultierenden kcat/KM-Werten von 590 ± 99 s−1 mM−1, 70 ± 9,7 s−1 mM−1 und 4,3 ± 0,72 s−1 mM−1. Allerdings nahm die katalytische Effizienz gegenüber diesen natürlichen Substraten im Präpro-DlPPO1 deutlich ab. Die kinetische Untersuchung mit (–)-Epicatechin ergab einen höheren KM-Wert (1,1 ± 0,12 mM), was darauf hindeutet, dass der Vorläufer eine geringere Spezifität gegenüber diesem Substrat aufweist als Pro-DlPPO1 (KM = 0,35 ± 0,052 mM). Somit wurde beobachtet, dass die katalytische Effizienz von prepro-DlPPO1 nur 33 ± 4,1 s−1 mM−1 betrug, was 23-fach niedriger ist als der Wert von pro-DlPPO1. Ebenso ist die Spezifität des Präpro-DlPPO1 gegenüber 4-Methylcatechol, Kaffeesäure und Pyrogallol geringer als die des Pro-DlPPO1, was durch die höheren KM-Werte im Vergleich zum Pro-DlPPO1 angezeigt wird. Daten zur natürlichen Substratspezifität von Präpro-DlPPO1 sind in Tabelle 3 und Abbildung S16 dargestellt. Die resultierenden kcat/KM-Werte von 17 ± 1,7 s−1 mM−1 (4-Methylcatechol), 2,5 ± 0,20 s−1 mM−1 (Kaffeesäure) und 15 ± 1,2 s−1 mM−1 (Pyrogallol) deuten darauf hin Die katalytische Effizienz von Präpro-DlPPO1 verringerte sich im Vergleich zu Pro-DlPPO1 um das 36-, 1,7- bzw. 4,7-fache. Somit könnte die Signalpeptidkomponente einer der Faktoren sein, die für die verringerte Rate von PPOs bei der Katalyse der Oxidation und Hydroxylierung von Phenolverbindungen verantwortlich sind.

Bei Konzentrationen von (–)-Epicatechin über 2 mM war die enzymatische Umwandlung langsamer als bei niedrigeren Substratkonzentrationen sowohl für Präpro-DlPPO1 als auch für Pro-DlPPO1 (Abbildungen S15A und S16A). Durch die Einbeziehung der kompetitiven Hemmung durch das Substrat selbst („Substrathemmung“, Gleichung S3) in das Michaelis-Menten-Modell konnte der modellierte Konzentrationsbereich auf bis zu 3 mM für pro-DlPPO1 und bis zu 5 mM für präpro-DlPPO1 erweitert werden. Eine Änderung des mathematischen Modells der enzymatischen Umwandlung führt zu erheblichen Änderungen der erhaltenen kinetischen Parameter. Für pro-DlPPO1 (KM = 4,6 ± 2,0 mM, kcat = 1500 ± 590 s−1, Ki = 0,56 ± 0,26 mM) sowie für prepro-DlPPO1 (KM = 6,1 ± 3,7 mM, kcat = 140 ± 72 s− 1, Ki = 1,2 ± 0,79 mM) werden sowohl KM als auch kcat signifikant erhöht (vergleiche Tabelle 3), um die neu eingeführte hemmende Wirkung des Substrats selbst (Ki) zu kompensieren, während die Varianzen aller angepassten Parameter im Vergleich zu den einfachen Parametern stark erhöht sind Michaelis-Menten-Modell. Für pro-DlPPO1 und Dopamin (Abbildung S13C; KM = 1,2 ± 0,11 mM, kcat = 250 ± 15 s−1, Ki = 30 ± 7,3 mM), wobei ein viel höherer Ki auf eine weniger effiziente Substrathemmung hinweist, ist die Inflation der Parameter zu beobachten Die Abweichungen sind weniger schwerwiegend und sowohl kcat als auch Km sind etwas niedriger als beim einfachen Michaelis-Menten-Modell.

Es wurde berichtet, dass das zweikernige Kupferzentrum von PPOs enantioselektiv funktioniert32. Die Enantioselektivität der katalytischen Reaktion von pro-DlPPO1 auf Tyrosin wurde untersucht. Das Enzym bevorzugte d-Tyrosin mit einer etwas höheren katalytischen Effizienz von 0,39 ± 0,016 s−1 mM−1 gegenüber dem l-Enantiomer (0,26 ± 0,016 s−1 mM−1). 1 mM d-Tyrosin wird mit einer Geschwindigkeit von 0,11 ± 0,01 U mg−1 umgewandelt, was 1,1-fach schneller ist als die Geschwindigkeit der l-Tyrosin-Umwandlung durch pro-DlPPO1. Der Effekt der Substratchiralität wurde auch bei Pilz-AbPPO4 beobachtet, wo l-Tyrosin etwas bevorzugter war als das d-Gegenstück3. Die von Streptomyces sp. produzierte Tyrosinase REN-21 reagierte 35,9-mal schneller auf L-Tyrosin als auf D-Tyrosin, was unter den PPOs den stärksten Enantioselektivitätseffekt auf das Substrat Tyrosin darstellt87. Die Bevorzugung eines d-Stereoisomer-Substrats wurde auch bei einem aus Auberginen (Solanum melongena) gereinigten PPO berichtet, bei dem die Umwandlung von 0,1 mM d-DOPA 1,8-fach schneller war als die von l-DOPA88. Ein weiteres Beispiel für die enantiospezifische Reaktion in pflanzlichen PPOs findet sich in der Larreatricinhydroxylase aus Larrea tridendata (LtPPO), die eine ausgeprägte Präferenz (23-fach) für (+)-Larreatricin im Vergleich zum (–)-Enantiomer aufweist, während im gleichen Die Studie AbPPO4 zeigt einen gegenteiligen Effekt, indem sie (–)-Larreatricin (13-fach) bevorzugt32.

Präpro-DlPPO1 und Pro-DlPPO1 wurden spektrophotometrisch mit H2O2 untersucht, um die Bildung des Oxy-Zustands des Enzyms in Gegenwart von Sauerstoff zu beurteilen. Die Zugabe von H2O2 zum Präpro-DlPPO1 führt zu einem Anstieg der spezifischen Absorptionsbande (~ 345 nm), was auf die sauerstoffinduzierte Oxyform hinweist, die für Typ-III-Kupferzentrumsenzyme charakteristisch ist und auf den Ladungstransfer zurückgeführt wurde Übergang von \({\text{O}}_{2}^{2 - } \left( {\pi_{\sigma }^{*} } \right) \zu {\text{Cu}}\left( {II} \right)_{{d_{{x^{2} - y^{2} }} }}\)89. Eine ähnliche Beobachtung wurde mit pro-DlPPO1 gemacht, wo die Oxyadduktbildung zur Bildung einer ausgeprägten Absorptionsbande bei 345 nm führte (Abb. 4). Die Absorption bei 345 nm wurde gesättigt, als die Titration ~ 150 Äquivalente H2O2 für Präpro-DlPPO1 bzw. ~ 175 Äquivalente H2O2 für Pro-DlPPO1 erreichte. Die resultierenden Absorptionskoeffizienten betragen ~ 9000 M−1 cm−1 pro Mol Enzym für das Präpro-DlPPO1 und ~ 10.300 M−1 cm−1 pro Mol Enzym für das Pro-DlPPO1. Die Bildung der Oxy-Form durch H2O2 wurde bereits für aus natürlichen Quellen gewonnene PPOs nachgewiesen60,90,91. Aus Zitronenmelisse (Melissa officinalis)86, Süßkartoffel (Ipomoea batatas)87 und Walnussblättern (Juglans regia)52 gereinigte Catecholoxidasen führten bei Zugabe von zwei Äquivalenten H2O2 zu einer vollständigen Sättigung der Oxyform. In der Catecholoxidase des Zigeunerkrauts (Lycopus europaeus) waren 6 Äquivalente H2O2 erforderlich, um die λ345-Bande zu sättigen, während in der Schwarzpappel (Populus nigra)89 80 Äquivalente H2O2 erforderlich waren. Es wurde berichtet, dass heterolog exprimiertes SlPPO1 und SlPPO2 aus Solanum lycopersicum17 bei 25 bzw. 11 Äquivalenten H2O2-Zugabe die vollständig gesättigte Oxyform erzeugen. Darüber hinaus induzierte die Zugabe von H2O2 den Wildtyp-CgAUS aus Coreopsis grandiflora, der heterolog in E. coli exprimiert wurde, zur vollständigen Bildung eines Oxy-Addukts bei 24 Äquivalenten H2O292,93. Die vorliegende Studie ist die erste, die die Oxyformbildung eines heterolog exprimierten Präpro-PPO untersucht, an das noch Signalpeptide gebunden sind.

UV/Vis-Spektren von pro-DlPPO1 und prepro-DlPPO1 nach Behandlung mit H2O2. (A) Gesamtspektren von pro-DlPPO1 nach Behandlung mit H2O2. Der Einschub zeigt die Absorption bei 345 nm im Vergleich zu den hinzugefügten Äquivalenten H2O2. (B) Gesamtspektren von Präpro-DlPPO1 nach Behandlung mit H2O2. Der Einschub zeigt die Absorption bei 345 nm im Vergleich zu H2O2-Äquivalenten. (C) Vergrößerte Ansicht der Spektren bei 300–400 nm des Pro-DlPPO1 nach Behandlung mit H2O2. (D) Nahaufnahme der Spektren bei 300–400 nm des Präpro-DlPPO1 nach Behandlung mit H2O2.

Um mehr Einblick in die Enzym-Substrat-Wechselwirkungen des Pro-DlPPO1 zu erhalten, wurden molekulare Docking-Studien durchgeführt. Die Simulationsstudien wurden mit der AutoDock Vina-Software94 durchgeführt. Das Strukturmodell von pro-DlPPO1 wurde wie in Materialien und Methoden beschrieben erstellt und für die rechnerischen Berechnungen verwendet. Bindungspositionen wurden für alle untersuchten Substrate berechnet (Abbildungen S17 und S18) und anhand der TYR-Struktur von Bacillus megaterium validiert, die das Substrat l-Tyrosin enthält, das an das Zn-substituierte aktive Zentrum gebunden ist (PDB: 4P6R)1. Die Ergebnisse lieferten detaillierte Informationen über die mutmaßliche Position der untersuchten Substrate und die Bindungsenergien dieser Positionen um das aktive Zentrum (Tabelle S3). Das natürliche Substrat (–)-Epicatechin zeigte die stärkste Bindungsaffinität unter den untersuchten Substraten, was durch die niedrigste gemessene KM (KM = 0,35 ± 0,052 mM) und die günstigste Bindungsenergie stark nahegelegt wird (Tabelle S3). Die höhere katalytische Effizienz in Kombination mit den ähnlichen KM-Werten von 4-Methylcatechol und Kaffeesäure weist darauf hin, dass 4-Methylcatechol mit DlPPO1 einen stabileren Komplex bildet als Kaffeesäure. Pyrogallol weist unter den getesteten natürlichen Substraten den höchsten KM auf, was auf schwache Bindungswechselwirkungen zwischen pro-DlPPO1 und dem Substrat schließen lässt. Die höhere katalytische Effizienz als bei Kaffeesäure ist auf den viel höheren kcat-Wert von Pyrogallol zurückzuführen (Tabelle 3).

Eine weitere Analyse mit LiqPlot + von (–)-Epicatechin, das an das aktive Zentrum des DlPPO1 angedockt ist, ergab die spezifischen Wechselwirkungen des Substrats mit den Aminosäuren rund um das aktive Dikupferzentrum. Insbesondere bildet eine der beiden Hydroxygruppen am o-Diphenolring des (–)-Epicatechins (Abb. 5) zwei Wasserstoffbrücken; eines mit dem Imidazol-Stickstoff des konservierten Kupfer-koordinierenden His243 (2,8 Å) und das zweite mit der Carboxyl-Rückgratgruppe von Met257 (2,8 Å). Die zweite Hydroxygruppe desselben Rings interagiert mit den beiden Kupferionen und ist für die oxidative Reaktion gut positioniert (CuA: 4,1 Å bzw. CuB: 3,7 Å). Darüber hinaus bedecken neun hydrophobe Wechselwirkungen mit den Resten His87, Asn109, Ala231, Glu235, Asn236, Gly258, Asn259, Phe260 und Ala263 den gesamten Substratkörper (Abb. 5). Ähnlich wie bei anderen pflanzlichen PPOs dreht sich der konservierte Phe26017, der Gatekeeper-Rest, zum Phenolring des (–)-Epicatechins und bildet π-π-Wechselwirkungen vom Sandwich-Typ. Die hohe Affinitätsbindung von (–)-Epicatechin zeigt die Präferenz pflanzlicher PPOs für phenolische Sekundärmetaboliten und lässt stark darauf schließen, dass (–)-Epicatechin ein physiologisches Substrat von DlPPO1 ist. Ähnliche Ergebnisse wurden für das Tomaten-PPO (SlPPO1) präsentiert, das eine hohe Affinität zum Dihydrochalcon Phloretin17 aufweist, und für die Auronsynthase aus Coreopsis grandiflora, für die Butein als natürliches Substrat vorgeschlagen wurde51,95.

Andocken von (–)-Epicatechin an DlPPO1. (A) Bindungsposition von (–)-Epicatechin im aktiven Zentrum von DlPPO1. (B) DlPPO1- und (–)-Epicatechin-Interaktionsdiagramm. Farbcodes: Magentafarbener Text stellt Reste dar, die Wasserstoffbrückenbindungen bilden, und olivfarbener Text markiert Reste, die hydrophobe Wechselwirkungen aufweisen. In (–)-Epicatechin sowie in den beiden Aminosäuren, die Wasserstoffbrückenbindungen bilden, werden Kohlenstoffatome als schwarz gefüllte Kreise, Sauerstoffatome rot, Stickstoffatome blau und das einzelne Schwefelatom im Wechselwirkungsdiagramm dargestellt wird orange hervorgehoben.

In dieser Arbeit wurde Präpro-DlPPO1 aus D. longan im Vergleich zu Pro-DlPPO1 exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dies ist der erste Bericht über die biochemischen Unterschiede zwischen einem in einem prokaryotischen System exprimierten PPO mit und ohne N-terminale Signalsequenz. Durch UV-Vis-Spektroskopie überwachte Titration mit H2O2 bestätigte, dass DlPPO1 ein Typ-III-Kupferzentrum enthält. Nach Zugabe von ~ 150 und ~ 175 Äquivalenten H2O2 war die Absorptionsbande um 345 nm, die auf die Oxy-Form hinweist, in prepro-DlPPO1 bzw. pro-DlPPO1 vollständig entwickelt (Abb. 4). Kinetische Experimente zeigten, dass beide Enzyme monophenolische Substrate akzeptieren, beide Formen von DlPPO1 wurden daher als Tyrosinasen klassifiziert (EC. 1.14.18.1). Das Pro-DlPPO1 zeigte niedrigere KM- und höhere kcat-Werte und folglich viel höhere kinetische Effizienzen gegenüber allen getesteten Substraten als das Präpro-DlPPO1 (Tabelle 3). Die N-terminalen Signalpeptide scheinen eine effiziente Barriere für die Substratbindung an das aktive Zentrum von DlPPO1 bereitzustellen. Der Einschluss der vermeintlich entfalteten Signalpeptide führte zu einer erheblichen thermischen Toleranz von prepro-DlPPO1, die sogar die thermische Stabilität von pro-DlPPO1 übertrifft (Abb. 3). In Kombination mit der hemmenden Wirkung der Signalpeptide auf die katalytische Funktion von DlPPO1 könnte die erhöhte Thermostabilität, die sie DlPPO1 verleihen, auf eine geordnetere und kompaktere Struktur dieser Peptide hinweisen, wie derzeit angenommen. (–)-Epicatechin zeigte die niedrigste KM, die höchste katalytische Effizienz (Tabelle 3), die günstigste Bindung an DlPPO1 (Tabelle S3 und Abb. 5) und auch die stärkste Substrathemmung unter allen untersuchten Substraten. Die Ergebnisse legen nahe, dass (–)-Epicatechin ein physiologisches Substrat von DlPPO1 ist. Diese Arbeit liefert Einblicke in die biochemischen und katalytischen Eigenschaften von Longan-PPO, die für zukünftige Eingriffe nach der Ernte zur wirksamen Bewältigung kostspieliger Fruchtbräunungsreaktionen nützlich sein werden.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von Sigma-Aldrich (Wien, Österreich) oder Carl-Roth (Karlsruhe, Deutschland) gekauft und hatten mindestens analytische Qualität. Enzyme zur Manipulation von Nukleinsäuren stammten von New England Biolabs (NEB; Frankfurt am Main, Deutschland) oder Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Longan-Blätter wurden in Lamphun (18,481174° N, 99,176014° E) im nördlichen Teil Thailands gesammelt, sofort ins Labor transportiert und bei –80 °C gelagert. Die Erlaubnis zum Sammeln von Longan-Blättern zu Forschungszwecken wurde vom örtlichen Eigentümer eingeholt. Gesunde Blätter wurden unter flüssigem Stickstoff gemahlen und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung der Rapid CTAB-Methode nach Gambino et al.96 mit einem Extraktionspuffer isoliert, der 2 % (m/v) Cetyltrimethylammoniumbromid, 2,5 % (m/v) Polyvinylpyrrolidon, 2 enthielt M NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, mit NaOH auf pH 8,0 eingestellt) und 2 % (v/v) β-Mercaptoethanol. Anschließend wurde cDNA unter Verwendung eines Poly-T-Primers (5'-T25VN-3') und der Reversen Transkriptase des Moloney Murine Leukemia Virus synthetisiert. Es wurden spezifische Primer für das Longan-PPO-Gen (prepro-DlPPO1 und pro-DlPPO1) entworfen (Tabelle S2). Die Primer wurden zur Amplifikation der PPO-Gene aus der cDNA-Matrize mithilfe der Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase (NEB) verwendet. PCR-Produkte wurden durch das folgende Verfahren in den pGEX-6P-SG69-Expressionsvektor kloniert: Der pGEX-6P-SG-Vektor (1 fmol) wurde mit 5 fmol des gereinigten Präpro-DlPPO1 oder 5 fmol des Pro-DlPPO1-Amplikons, 6, inkubiert Anschließend folgten mM Adenosintriphosphat (ATP), 4 Einheiten Esp3I (Thermo Fisher Scientific) und 160 Einheiten T4-DNA-Ligase (NEB) in einem Gesamtvolumen von 6 μl 1 × CutSmart-Puffer (NEB) für 90 Minuten bei 30 °C durch Enzyminaktivierung bei 65 °C für 20 Minuten. Die erhaltenen Plasmide wurden in chemisch kompetente SHuffle T7 Express-Zellen (NEB) transformiert. Die Transformanten wurden auf LB-Agarplatten, ergänzt mit 100 mg L−1-Ampicillin, durch Inkubation bei 37 °C über Nacht selektiert. Positive Klone wurden mit Kolonie-PCR nachgewiesen und mittels Sanger-Sequenzierung, durchgeführt von der Microsynth GmbH (Wien, Österreich), verifiziert.

In den rekombinanten Plasmiden sind die Gene prepro-DlPPO1 und pro-DlPPO1 N-terminal mit dem GST-Tag des pGEX-6P-SG-Vektors fusioniert. Die Erkennungssequenz der humanen Rhinovirus-3C-Protease (HRV3C) (LEVLFQ|GP) befindet sich zwischen dem GST-Tag und dem Zielgen und ermöglicht die kontrollierte proteolytische Dissoziation des Tags vom interessierenden Protein nach der Reinigung. Die beiden Fusionsgene (GST-prepro-DlPPO1 und GST-pro-DlPPO1) wurden mithilfe des synthetischen tac-Promotors des pGEX-6P-SG-Vektors effizient überexprimiert. Der SHuffle T7 Express E. coli-Stamm wurde in einem modifizierten 2xYT-Medium (1,6 % (m/v) Trypton-Pepton, 1 % (m/v) Hefeextrakt, 1 % (m/v) NaCl, 0,5 % (m/v) gezüchtet /v) NH4Cl, 0,5 % (v/v) Glycerin, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2; eingestellt auf pH 7,5) in Gegenwart von Ampicillin (100 mg/L). Übernachtkulturen wurden bei 37 °C gezüchtet. Die Expressionschargen wurden mit den gesättigten Übernachtkulturen beimpft und bei der gleichen Temperatur etwa 4 Stunden lang gezüchtet (Ausgangs-OD600 von 0,05), bis die OD600 einen Wert von 0,6–0,8 erreichte. Um die Proteinmenge zu optimieren und gleichzeitig die Bildung von Einschlusskörpern zu vermeiden, wurde die Temperatur zur Expression auf 17,5 °C gesenkt. Die Kulturen wurden mit 0,5 mM IPTG induziert und mit 2,0 mM CuSO4 versetzt. Die Expressionskulturen blieben 48 Stunden lang unter Schütteln bei 17,5 °C. Als die OD600 einen Wert von 7–10 erreichte, wurden die Kulturen durch 25-minütige Zentrifugation bei 6500 × g und 4 °C gesammelt.

Die Zelllyse wurde unter Verwendung der Gefrier-Auftau-Technik unter Verwendung von flüssigem Stickstoff durchgeführt. Die Pellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA und 50 mM Saccharose) resuspendiert. Lysozym (0,5 g/L) und Proteaseinhibitoren (1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Benzamidin) wurden zugesetzt, um die bakteriellen Zellwände zu lysieren bzw. den Proteinabbau durch endogene Proteasen zu verhindern. Die Suspensionen wurden geschüttelt und 45 Minuten lang auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Mischungen fünf Zyklen lang in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend in einem 25 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Nach der 5. Runde des Einfrier-Auftau-Verfahrens wurden 2 mM MgCl2 und 0,02 g/L DNaseI zugegeben, um die durch die aus den Bakterienzellen freigesetzte DNA verursachte Viskosität der Lösungen zu beseitigen und die Proteinextraktion zu verbessern. Anschließend wurden die Lysate 1 Stunde lang bei 4 °C und 7500 × g zentrifugiert.

Chromatografische Reinigungen wurden mit einem ÄKTA Purifier (GE Healthcare) durchgeführt, der in einem Kühlschrank bei 4 °C aufgestellt wurde. Die filtrierten Lysate wurden in eine 50-ml-Injektionsschleife gegeben und auf eine vorgepackte 5-ml-GSTrap-FF-Säule aufgetragen, wobei eine Lösung aus 50 mM Tris-HCl und 250 mM NaCl, pH 7,5, als Bindungspuffer verwendet wurde. Die Ziel-GST-Fusionsproteine ​​wurden auf der Säule festgehalten, während die ungebundenen Proteine ​​durch den Bindungspuffer mit einer Flussrate von 1 ml/min und den Chaperon-Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl2) herausgespült wurden und 5 mM Na-ATP, eingestellt auf pH 8; angewendet auf 15 Säulenvolumina), um bindende Chaperone von den Zielfusionsproteinen zu entfernen. Schließlich wurden die gewünschten Proteine ​​mit 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl und 15 mM reduziertem Glutathion, eingestellt auf pH 7,5, eluiert. Die GST-Fusionsproteinfraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung eines Vivaspin-Ultrazentrifugationsgeräts mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 30 kDa (Sartorius; Göttingen, Deutschland) konzentriert. Um Glutathion zu entfernen, wurde der Puffer dann gegen 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 250 mM NaCl ausgetauscht. Anschließend wurden die Proben mit einer selbst3 hergestellten GST-HRV3C-Protease im Massenverhältnis 1:50 (Protease:GST-Fusionsprotein) gemischt. Die Proteolyse wurde über 48 Stunden bei 4 °C durchgeführt. Anschließend wurden die gespaltenen Proteine ​​erneut auf eine 5 mL GSTrap FF-Säule aufgetragen. Zu diesem Zeitpunkt waren das GST-Protein und die GST-markierte Protease in der Säule gefangen, während die PPOs durch die Säule fließen konnten und sofort eluiert wurden. Die Proteinfraktionen von prepro-DlPPO1 und pro-DlPPO1 wurden gesammelt, konzentriert und in 100 mM MES und 200 mM NaCl pH 6,5 mit 30 % (v/v) Glycerin bei –80 °C gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes97 basierend auf der Absorption bei 280 nm und dem Extinktionskoeffizienten von ExPASy ProtParam98 bestimmt. Die vorhergesagte Molekülmasse der exprimierten Proteine ​​wurde aus dem Atomgewicht und der Standardisotopenzusammensetzung der Bestandteile74 geschätzt. Der Kupfergehalt der Enzyme präpro-DlPPO1 und pro-DlPPO1 wurde nach Ansäuern mit Essigsäure und Reduktion von Cu(II) zu Cu(I) mit Ascorbat photometrisch bestimmt, was die Chelatisierung von Cu(I) um 2,2′ ermöglichte. -Biquinolin nach der von Hanna et al.73 veröffentlichten Methode.

Die Massenbestimmung von prepro-DlPPO1 und pro-DlPPO1 wurde mit einem ESI-LTQ-Orbitrap Velos-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific Bremen, Deutschland) mit einem Massenbereich von 200–4000 m/z und einer Massengenauigkeit von nahezu 3 ppm mit externen Messungen durchgeführt Kalibrierung. Vor der MS wurden 100 µg der Proteinlösungen in 5 mM Natriumacetatpuffer (pH 7,0) ausgetauscht. Die Proteinlösungen wurden unmittelbar vor der Anwendung im Massenspektrometer 100-fach in einer Mischung aus 80 % (v/v) Acetonitril und 0,1 % (v/v) Ameisensäure verdünnt.

Die denaturierende SDS-PAGE wurde wie von Laemmli et al.99 beschrieben in einem Mini-Gel-Gerät (Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad) durchgeführt. Präpro-DlPPO1 und Pro-DlPPO1 wurden in Gelladepuffer verdünnt, der 30 g/l SDS, 6 % (v/v) Glycerin, 75 mM Tris, 2,5 % (v/v) 2-Mercaptoethanol und 50 mg/l enthält Bromphenolblau auf pH 6,8 eingestellt. Die Proben wurden 5 Minuten lang auf 99 °C (Thermomixer Comfort, Eppendorf) erhitzt, um die Denaturierung zu unterstützen. Die Proben wurden dann zusammen mit einem Molekulargewichtsstandard (Precision Plus Protein Standard Dual Color, Bio-Rad) auf die 5 %igen Stapel- und 11 % auflösenden Polyacrylamidgele aufgetragen, um Informationen über die Größe und Reinheit der Proteine ​​zu erhalten. Die Elektrophorese wurde bei 120 V durchgeführt. Die Gele wurden in Farbstofflösung (200 mg/L Coomassie Brilliant Blue G-250, 50 g/L Al2(SO4)3·16 H2O, 10 % (v/v) Ethanol und 20 g/L gefärbt H3PO4) und wurden anschließend mit 10 % (v/v) Ethanol und 20 g/L ortho-Phosphorsäure entfärbt. Fotos der Gele wurden mit dem BioRad Gel Doc XR Imaging System aufgenommen.

Der thermische Verschiebungstest wurde durchgeführt, um die Schmelzpunkte der beiden Isoenzyme im Lagerpuffer (50 mM MES pH 6,5 und 200 mM NaCl) zu messen und so die Stabilität der beiden Zustände des Enzyms zu bestimmen. Der Assay wurde dreimal unter Verwendung von PCR-Röhrchen (Axygen, INC Corning) in einem Echtzeit-PCR-Gerät (Mastercycler ep-realplex, Eppendorf) durchgeführt. Die Reaktionslösungen enthielten 10 µM Enzym und 4 × SYPRO Orange (Sigma-Aldrich) im Lagerpuffer. Die Proben wurden in der PCR-Maschine schrittweise in Schritten von einem K pro Minute von 4 °C auf 94 °C erhitzt, während die Änderung der Fluoreszenzintensität nach der Anregung bei 470 nm bei 560 nm überwacht wurde. Die resultierenden Fluoreszenzintensitäten der Lösungen, die jedes Enzym enthielten, wurden dann zur Stabilitätsanalyse gegen die Temperatur aufgetragen.

Die DlPPO1-Aktivitäten wurden spektrophotometrisch bestimmt, indem der Anstieg der Absorption bei 480 nm nach der Umwandlung von Tyramin durch das Enzym überwacht wurde. Die Standardmessungen wurden unter Verwendung von 0,5 µg des Enzyms und 8 mM Tyramin in einem Gesamtreaktionsvolumen von 200 µL mit der ermittelten optimalen SDS-Konzentration (0,25 mM) zur Aktivierung von prepro-DlPPO1 oder pro-DlPPO durchgeführt. Ohne SDS wurden für die getesteten Substrate keine verwertbaren Absorptions-Zeit-Kurven erhalten (Abbildung S12). Absorptionskurven und -spektren wurden bei 25 °C in einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines TECAN Infinity M200 (Tecan) aufgezeichnet. Die Aktivitäten wurden aus der Steigung des anfänglichen linearen Teils der experimentellen Kurven (Absorption vs. Zeit) bestimmt und in U/min ausgedrückt. Eine Einheit enzymatischer Aktivität (U) wurde als die Enzymmenge definiert, die die Bildung von 1 μmol Chinonen pro Minute katalysierte (1 U = 1 μmol/min). Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Optimierungen der SDS-Konzentration und des pH-Werts des Reaktionspuffers im Hinblick auf die Pro-DlPPO1-Aktivität sind wie folgt (siehe unten).

Die Messungen (200 µL) wurden in Gegenwart verschiedener SDS-Konzentrationen (0,00, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25 und 1,50 mM) unter Verwendung von 0,5 µg pro-DlPPO1 und 8 mM Tyramin in 50 mM MES durchgeführt pH-Wert 7,0. Die optimale SDS-Konzentration wurde anschließend in allen weiteren folgenden Studien verwendet.

Als Reaktionspuffer wurde eine Reihe von MES- und Tris-Puffer über einen pH-Bereich von 5,5–8,5 verwendet, um den günstigsten pH-Wert zu bestimmen, der die beste Enzymaktivität für weitere Kinetikstudien bietet. Jede Reaktion (200 µL) wurde mit einer Pufferkonzentration von 50 mM unter Verwendung von 0,5 µg pro-DlPPO1, 8 mM Tyramin und der optimalen SDS-Konzentration aus dem vorherigen Experiment durchgeführt.

Die Substratspezifität von Präpro-DlPPO1 und Pro-DlPPO1 wurde unter Verwendung verschiedener phenolischer Substrate untersucht. Anschließend wurden die Substrate ausgewählt, die zu guten Aktivitäten führten, um die kinetischen Parameter zu bestimmen. Die Aktivitäten wurden spektrophotometrisch auf zwei Standard-Monophenolsubstraten (Tyramin, L- und D-Tyrosin), zwei Standard-Diphenolverbindungen (Dopamin und L-DOPA) und vier natürlichen Phenolsubstraten ((–)-Epicatechin, 4-Methylcatechol, Pyrogallol und Kaffeesäure) bewertet Säure). Die Absorptionskurven der gefärbten Produkte wurden auf einem TECAN Infinity M200 für verschiedene Molaritäten des jeweiligen Substrats überwacht. Die Reaktionsmischung (Gesamtvolumen 200 µL) enthielt variable Mengen des Enzyms (siehe Tabelle S4, gelagert in 100 mM MES und 200 mM NaCl bei pH 6,5) und 0,25 mM SDS in der Reaktionslösung aus 50 mM MES-Puffer bei pH 7 Die molaren Absorptionskoeffizienten (ɛλmax) der gebildeten Chromophore sind in Tabelle S4 und Abbildung S19 angegeben. Zur Durchführung der kinetischen Experimente wurden etwa 7–8 Substratkonzentrationen um einen vorläufigen KM-Wert gewählt, sofern die begrenzte Substratlöslichkeit dies zuließ (Abbildungen S13–S16). Die KM- und vmax-Werte wurden durch nichtlineare Regression unter Verwendung des Levenberg-Marquardt-Algorithmus100 berechnet, der mit Anfangswerten für die Modellparameter versorgt wurde, die aus der Anwendung der Hanes-Woolf-Linearisierung101 der Michaelis-Menten-Gleichung (Gleichung S1) abgeleitet wurden. Die maximale Umsatzrate (kcat, Gleichung S2) wurde ermittelt, indem die Gesamtzahl der pro Minute umgewandelten Substratmoleküle durch die Gesamtzahl der im Reaktionsvolumen vorhandenen Enzymmoleküle dividiert wurde. Für Kombinationen aus Enzym und Substrat, die eine Substrathemmung zeigen, wurde die Michaelis-Menten-Gleichung um die Hemmung durch das Substrat erweitert (Gleichung S3).

Präpro-DlPPO1 und Pro-DlPPO1 wurden spektrophotometrisch mit H2O2 untersucht, das die Bildung des charakteristischen Oxy-Zustands von Typ-III-Kupferenzymen induziert102. Die Zugabe von H2O2 zum Präpro-DlPPO1 oder Pro-DlPPO1 führt zur Bildung einer neuen Absorptionsbande um etwa 345 nm, die für den Peroxid-induzierten Oxyzustand des Dikupferzentrums charakteristisch ist87. In diesen Experimenten wurden 255 µg pro-DlPPO1 (ε280 = 74.300 M−1 cm−1) oder 300 µg präpro-DlPPO1 (ε280 = 74.425 M−1 cm−1) in 200 µL des Lagerpuffers (100 mM) gemischt MES und 200 mM NaCl pH 6,5). Der Lösung wurden mehrere Äquivalente H2O2 zugesetzt, bis die Sättigung des charakteristischen Peaks bei ~ 345 nm erreicht war. Nach jeder Zugabe eines weiteren Äquivalents H2O2 zum untersuchten Enzym ließ man genügend Zeit (mindestens jedoch 5 Minuten), bis die Absorption bei der charakteristischen Wellenlänge von 345 nm stabil war, und erst dann wurde das nächste Äquivalent H2O2 zugegeben. Die Messung endete, als der charakteristische Peak (~ 345 nm) mit zusätzlichem H2O2 nicht weiter anstieg.

Die Aminosäuresequenz von pro-DlPPO1 (Ala1-Asp503) wurde an den SWISS-MODEL103,104-Server übermittelt. Zu Beginn suchte die Pipeline auf Basis von BLAST105 und HHblits106 nach einem passenden Template der untersuchten Sequenz (OU702517). Die Suche ergab MdPPO166, Malus Domestica TYR 1 (PDB: 6ELS)35,36 als Treffer mit dem höchsten Abdeckungswert (0,86, mit 69,80 % Sequenzidentität). Das endgültige Homologiemodell des pro-DlPPO1 wurde dann unter Verwendung der 6ELS-Struktur als Vorlage erstellt und die Visualisierung erfolgte mit dem PyMol Molecular-Grafiksystem (Schrödinger, LLC)107.

Das molekulare Andocken wurde mit der AutoDock Vina-Software94 durchgeführt. Mithilfe von Docking-Studien wurden die Bindungspositionen der untersuchten natürlichen Substrate (–)-Epicatechin, 4-Methylcatechol, Kaffeesäure, Pyrogallol und der Standardsubstrate Dopamin, L-DOPA, Tyramin, L-Tyrosin und D-Tyrosin im Dikupfer identifiziert aktives Zentrum von pro-DlPPO1. Das molekulare Modell des pro-DlPPO1 wurde für das molekulare Andocken vorbereitet, wie zuvor für MdPPO166 beschrieben. Insbesondere wurde aus der mutmaßlichen Struktur von pro-DlPPO1 die C-terminale Domäne (Pro336-Asp503) entfernt und nur die aktive Domäne (Ala1-Val335) für die Docking-Studien verwendet. Darüber hinaus wurde der Gatekeeper-Rückstand (Phe260) als flexibler Rückstand definiert, da seine Flexibilität für Anlagen-PPOs verifiziert wurde17. Die Struktur aller Substrate wurde vom PubChem-Server heruntergeladen108, dann in das 3D-PDB-Format übersetzt und mit AutoDockTools (ADT, v. 1.5.6)109 in pdbqt-Dateien konvertiert. Für alle Substrate wurde die größtmögliche Anzahl aktiver Torsionen gewählt. Polare Wasserstoffe wurden den Strukturen von ADT zugeordnet und auch in den pdbqt-Dateien des Substrats gespeichert. In allen Experimenten war das Suchgitter in der Mitte der beiden Kupferionen im aktiven Zentrum zentriert und über einen Würfel (12 × 12 × 12 Å3, Gitterpunktabstand: 1 Å) mit Kanten parallel zu den drei Koordinatenachsen verteilt Ziel-DlPPO1-Modell. Anschließend wurde AutoDock/Vina zum Andocken verwendet, indem die untersuchten Enzyme und Inhibitoren zusammen mit den Grid-Box-Eigenschaften in der Konfigurationsdatei bereitgestellt wurden. Für alle Messungen wurde der Energiebereich auf 5 und die Vollständigkeit auf 50 eingestellt. Beim Andocken wurden die Bindungspositionen durch Überlagerung des kokristallisierten Substrats L-Tyrosin aus der BmTYR-Kristallstruktur (PDB: 4P6R)1 bewertet. Posen, die stark von der Bindungsposition von L-Tyrosin in der BmTYR-Struktur abwichen (dh Substratpositionen, bei denen der Phenolring nicht mit dem Dikupferzentrum interagierte), wurden als „unvernünftige“ Posen charakterisiert. Angemessene Docking-Konfigurationen (der Phenolring ist mit den Kupferionen verbunden, ähnlich wie bei BmTYR (PDB: 4P6R)1) wurden mit der Visualisierungssoftware PyMol Molecular Graphic System (Schrödinger, LLC)107 als 3D-Bild dargestellt.

Nach der Docking-Studie wurden sinnvolle Bindungspositionen von Interesse als PDB-Dateien gespeichert und mit der Software LigPlot +110,111 weiter visualisiert, um die Wechselwirkungen zwischen dem Liganden (–)-Epicatechin und den interagierenden Aminosäureresten um das aktive Zentrum herum zu bewerten. Laufzeitparameter wurden wie von der Software vorgeschlagen definiert. Insbesondere waren Wasserstoffbrückenbindungen bis zu einem maximalen Bereich von 2,70 Å zwischen einem Wasserstoff und einem Wasserstoffakzeptor und auch bis zu einem maximalen Bereich von 3,35 Å zwischen einem Wasserstoffdonor und einem Wasserstoffakzeptor zulässig. Nicht gebundene Kontaktparameter wurden als maximale Abstände von 2,90 Å zwischen den hydrophoben Kohlenstoffatomen des Liganden und des Proteins und von 3,90 Å zwischen Schwefelatomen des Liganden und des Proteins definiert.

Alle in dieser Studie beschriebenen Pflanzenversuche entsprachen den relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen.

Die im Rahmen der vorgestellten Studie generierten und analysierten Sequenzen sind im Repository des European Nucleotide Archive (ENA) unter den Akzessionen OU702517 (partielles Pro-DlPPO1-Gen) und OU702518 (Präpro-DlPPO1-Gen) verfügbar.

Goldfeder, M., Kanteev, M., Isaschar-Ovdat, S., Adir, N. & Fishman, A. Die Bestimmung der Tyrosinase-Substratbindungsmodi zeigt mechanistische Unterschiede zwischen Typ-3-Kupferproteinen. Nat. Komm. 5, 1–5. https://doi.org/10.1038/ncomms5505 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Mauracher, SG et al. Eine hochgradige Proteinreinigung ermöglicht die eindeutige Polypeptidbestimmung der latenten Isoform PPO4 der Pilztyrosinase. Phytochemie 99, 14–25. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.12.016 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pretzler, M., Bijelic, A. & Rompel, A. Heterologe Expression und Charakterisierung der funktionellen Pilztyrosinase (AbPPO4). Wissenschaft. Rep. 7, 1–10. https://doi.org/10.1038/s41598-017-01813-1 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Kim, H. et al. Eine kälteadaptierte Tyrosinase mit einem ungewöhnlich hohen Monophenolase/Diphenolase-Aktivitätsverhältnis, die aus dem Meeresarchäon Candidatus Nitrosopumilus koreensis stammt. Biotechnologie. Lette. 38, 1535–1542. https://doi.org/10.1007/s10529-016-2125-0 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mayer, AM Polyphenoloxidasen in Pflanzen und Pilzen: Gehende Orte? Eine Rezension. Phytochemie 67, 2318–2331. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.08.006 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, Y., Wang, Y., Jiang, H. & Deng, J. Die Kristallstruktur der Prophenoloxidase aus Manduca sexta bietet Einblicke in den Mechanismus von Typ-3-Kupferenzymen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 106, 17002–17006. https://doi.org/10.1073/pnas.0906095106 (2009).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, A. et al. Insekten-Prophenoloxidase: Der Blick über die Immunität hinaus. Vorderseite. Physiol. 5, 1–15. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00252 (2014).

Artikel ADS Google Scholar

Lai, X., Soler-Lopez, M., Wichers, HJ & Dijkstra, BW Rekombinante Expression und Reinigung menschlicher Tyrosinase im großen Maßstab, geeignet für Strukturstudien. PLoS ONE 11, 1–16. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161697 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Lai, Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9812–9815. https://doi.org/10.1002/anie.201704616 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Sánchez-Ferrer, Á., Rodríguez-López, JN, Garcia-Cánovas, F. & Garcia-Carmona, F. Tyrosinase: Eine umfassende Übersicht über ihren Mechanismus. Biochim. Biophys. Gesetz 1247, 1–11. https://doi.org/10.1016/0167-4838(94)00204-t (1995).

Artikel PubMed Google Scholar

Bijelic, A., Pretzler, M., Molitor, C., Zekiri, F. & Rompel, A. Die Struktur einer pflanzlichen Tyrosinase aus Walnussblättern zeigt die Bedeutung von „substratführenden Resten“ für die enzymatische Spezifität. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 14677–14680. https://doi.org/10.1002/anie.201506994 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Bijelic, A., Pretzler, M., Molitor, C., Zekiri, F. & Rompel, A. Kristallstruktur einer pflanzlichen Tyrosinase aus Walnussblätter: Die Bedeutung "substratlenkender Aminosäurenreste" für die Enzymspezifität. Angew. Chem. 127, 14889–14893. https://doi.org/10.1002/ange.201506994 (2015).

Artikel ADS Google Scholar

Malkin, R. & Malmstrom, BG Der Zustand und die Funktion von Kupfer in biologischen Systemen. Adv. Enzymol. Verwandt. Bereiche Molekularbiol. 33, 177–244. https://doi.org/10.1002/9780470122785.ch4 (1970).

Artikel CAS Google Scholar

Klabunde, T., Eicken, C., Sacchettini, JC & Krebs, B. Kristallstruktur einer pflanzlichen Catecholoxidase, die ein Dikupferzentrum enthält. Nat. Struktur. Biol. 5, 1084–1090. https://doi.org/10.1038/4193 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eicken, C., Krebs, B. & Sacchettini, JC Catecholoxidase – Struktur und Aktivität. Curr. Meinung. Struktur. Biol. 9, 677–683. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(99)00029-9 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Malmström, BG Enzymologie des Sauerstoffs. Annu. Rev. Biochem. 51, 21–59. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.51.070182.000321 (1982).

Artikel PubMed Google Scholar

Kampatsikas, I., Bijelic, A. & Rompel, A. Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Tomaten-Polyphenoloxidasen liefert neue Einblicke in ihre Substratspezifität. Wissenschaft. Rep. 9, 4022. https://doi.org/10.1038/s41598-019-39687-0 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solano, F. Melanine: Hautpigmente und vieles mehr – Typen, Strukturmodelle, biologische Funktionen und Bildungswege. Neue J. Sci. 2014, 1–28. https://doi.org/10.1155/2014/49827 (2014).

Artikel Google Scholar

Aderson, JV, Fuerst, EP, Hurkman, WJ, Vensel, WH & Morris, CF Biochemische und genetische Charakterisierung von Weizenkern-Polyphenoloxidasen (Triticum spp.). J. Cereal Sci. 44, 353–367. https://doi.org/10.1016/j.jcs.2006.06.008 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Bibhuti Bhusan Mishra, B. Polyphoneloxidasen: Biochemische und molekulare Charakterisierung, Verteilung, Rolle und ihre Kontrolle. Enzym. Ing. 5, 1–9. https://doi.org/10.4172/2329-6674.1000141 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Tran, LT, Taylor, JS & Constabel, CP Die Polyphenoloxidase-Genfamilie in Landpflanzen: Abstammungsspezifische Duplikation und Expansion. BMC Genomics 13, 395. https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-395 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommer, A., N, eeman, E., Steffens, JC, Mayer, AM & Harel, E. Import, Targeting und Verarbeitung einer pflanzlichen Polyphenoloxidase. Pflanzenphysiologie. 105, 1301–1311. https://doi.org/10.1104/pp.105.4.1301 (1994).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koussevitzky, S., Ne, E., Sommer, A., Steffens, JC & Harel, E. Reinigung und Eigenschaften eines neuartigen Chloroplastenstromas. J. Biol. Chem. 273, 27064–27069. https://doi.org/10.1074/jbc.273.42.27064 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Valero, E. & Garcia-Carmonatt, F. pH-induzierte kinetische Kooperativität einer Thylakoid-gebundenen Polyphenoloxidase. Biochem. J. 286, 623–626. https://doi.org/10.1042/bj2860623 (1992).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mauracher, SG, Molitor, C., Al-Oweini, R., Kortz, U. & Rompel, A. Latente und aktive abPPO4-Pilztyrosinase, kokristallisiert mit Hexatungstotellurat (VI) in einem Einkristall. Acta Cryst. D Biol. Kristalllogr. 70, 2301–2315. https://doi.org/10.1107/S1399004714013777 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Sugumaran, M. & Nellaiappan, K. Lysolecithin – ein wirksamer Aktivator der Prophenolxidase aus der Hämolymphe des Hummers, Homarus Americans. Biochem. Biophys. Res. Komm. 176, 1371–1376. https://doi.org/10.1016/0006-291x(91)90438-d (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tolbert, NE Aktivierung der Polyphenoloxidase von Chloroplasten. Pflanzenphysiologie. 51, 234–244. https://doi.org/10.1104/pp.51.2.234 (1973).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gauillard, F. & Richard-Forget, F. Polyphenoloxidasen aus Williamsbirne (Pyrus communis L, cv Williams): Aktivierung, Reinigung und einige Eigenschaften. J. Sci. Lebensmittel Landwirtschaft. 74, 49–56. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0010(199705)74:1%3c49::aid-jsfa769%3e3.0.co;2-k (1997).

3.0.co;2-k" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0010%28199705%2974%3A1%3C49%3A%3Aaid-jsfa769%3E3.0.co%3B2-k" aria-label="Article reference 28" data-doi="10.1002/(sici)1097-0010(199705)74:13.0.co;2-k">Artikel CAS Google Scholar

Golbeck, JH & Cammarata, KV Spinat-Thylakoid-Polyphenoloxidase. Pflanzenphysiologie. 67, 977–984. https://doi.org/10.1104/pp.67.5.977 (1981).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kenten, RH Latente Phenolase in Extrakten aus Blättern der Saubohne (Vicia faba L.). Biol. Chem. https://doi.org/10.1042/bj0670300 (1957).

Artikel Google Scholar

Gandia-Herrero, F., Cabanes, MJ, Garcıa-Carmona, F. & Escribano, J. Hinweise auf eine gemeinsame Regulierung bei der Aktivierung einer Polyphenoloxidase durch Trypsin und Natriumdodecylsulfat. Biol. Chem. 386, 601–607. https://doi.org/10.1515/BC.2005.070 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martin, HJ et al. Totalsynthese, stereochemische Zuordnung und divergente enantioselektive enzymatische Erkennung von Larreatricin. Chem. EUR. J. 24, 15756–15760. https://doi.org/10.1002/chem.201803785 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. & García-Carmona, F. Substratabhängige Aktivierung der latenten Kartoffelblatt-Polyphenoloxidase durch anionische Tenside. J. Agrar. Lebensmittelchem. 41, 1583–1586. https://doi.org/10.1021/jf00034a010 (1993).

Artikel Google Scholar

Derardja, A., Pretzler, M., Kampatsikas, I., Barkat, M. & Rompel, A. Reinigung und Charakterisierung der latenten Polyphenoloxidase aus Aprikose (Prunus armeniaca L.). J. Agrar. Lebensmittelchem. 65, 8203–8212. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b03210 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. & Rompel, A. Eine peptidinduzierte Selbstspaltungsreaktion initiiert die Aktivierung von Tyrosinase. Angew. Chem. Int. Ed. 58, 7475–7479. https://doi.org/10.1002/anie.201901332 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. & Rompel, A. Eine peptidvermittelte Selbstspaltungsreaktion initiiert die Tyrosinaseaktivierung. Angew. Chem. 131, 7553–7557. https://doi.org/10.1002/ange.201901332 (2019).

Artikel ADS Google Scholar

Tindall, HD Seifenfrüchte: Botanik und Gartenbau. Hortisch. Rev. (Am. Soc. Hortic. Sci.) 16, 143–196. https://doi.org/10.1002/9780470650561.ch5 (1994).

Artikel Google Scholar

Zhang, X., Guo, S., Ho, C. & Bai, N. Phytochemische Bestandteile und biologische Aktivitäten von Longanfrüchten (Dimocarpus longan Lour.): Eine Übersicht. Lebensmittelwissenschaft. Summen. Wellness 9, 95–102. https://doi.org/10.1016/j.fshw.2020.03.001 (2020).

Artikel Google Scholar

Rangkadilok, N., Worasuttayangkurn, L., Bennett, RB & Satayavivad, J. Identifizierung und Quantifizierung von Polyphenolverbindungen in Longanfrüchten (Euphoria longana Lam.). J. Agrar. Lebensmittelchem. 53, 1387–1392. https://doi.org/10.1021/jf0403484 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

He, N. et al. Isolierung und Identifizierung von Polyphenolverbindungen in Longan-Perikarp. Sep. Reinigungstechnologie 70, 219–224. https://doi.org/10.1016/j.seppur.2009.09.019 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Zhang, R., Khan, SA, Lin, Y., Guo, D. & Pan, X. Phenolprofile und zelluläre antioxidative Aktivität von Longan-Fruchtfleisch von 24 repräsentativen chinesischen Sorten. Int. J. Food Prop. 21, 746–759. https://doi.org/10.1080/10942912.2018.1425705 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Prasad, KN et al. Antioxidative und krebshemmende Wirkung des Hochdruck-Extrakts aus der Fruchthülle des Longan (Dimocarpus longan Lour.). Innov. Lebensmittelwissenschaft. Emerg. Technol. 10, 413–419. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2009.04.003 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, J. et al. Strukturaufklärung und Bewertung der antioxidativen Aktivität wichtiger Phenolverbindungen, die aus Longansamen (Dimocarpus longan Lour.) isoliert wurden. J. Funktion Lebensmittel 17, 872–880. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.06.028 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Sudjaroen, Y. et al. Isolierung und Charakterisierung von Ellagitanninen als den wichtigsten polyphenolischen Bestandteilen von Longan-Samen (Dimocarpus longan Lour). Phytochemie 77, 226–237. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2011.12.008 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, Y., Zhang, Z., Joyce, DC & Ketsa, S. Nacherntebiologie und Umgang mit Longanfrüchten (Dimocarpus longan Lour.). Nachernte Biol. Technol. 26, 241–252. https://doi.org/10.1016/S0925-5214(02)00047-9 (2002).

Artikel Google Scholar

Jiang, Y., Joyce, D. & Lin, H. Longan (Dimocarpus longan Lour.). In der Nacherntebiologie und -technologie tropischer und subtropischer Früchte. https://doi.org/10.1016/B978-1-84569-735-8.50016-4 (Woodhead Publishing Limited, 2011).

Lin, HT, Chen, SJ, Chen, JQ & Hong, QZ Aktuelle Situation und Fortschritte bei der Lagerung und dem Transport von Longan-Früchten nach der Ernte. Acta Hortic. 558, 343–351. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2001.558.56 (2001).

Artikel Google Scholar

Prasad, K., Neha, P. & Lal, MK Anbau- und Nachernte-Handhabungstechniken der potenziellen zukünftigen Nutzpflanze „Longan“ (Dimocarpus longan Lour) im asiatisch-pazifischen Raum – Ein Überblick. Res. Ernte. 18, 384–392. https://doi.org/10.5958/2348-7542.2017.00067.5 (2017).

Artikel Google Scholar

Chaikham, P., Apichartsrangkoon, A. & Seesuriyachan, P. Physikalische und biochemische Eigenschaften von unter Druck stehenden und pasteurisierten Longansäften bei der Lagerung. Emirates J. Food Agric. 26, 218–228. https://doi.org/10.9755/ejfa.v26i3.16576 (2014).

Artikel Google Scholar

Taranto, F. et al. Polyphenoloxidasen in Nutzpflanzen: Biochemische, physiologische und genetische Aspekte. Int. J. Mol. Wissenschaft. 18, 377–392. https://doi.org/10.3390/ijms18020377 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Molitor, C., Mauracher, SG & Rompel, A. Aurone-Synthase ist eine Catechol-Oxidase mit Hydroxylase-Aktivität und bietet Einblicke in den Mechanismus pflanzlicher Polyphenol-Oxidasen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 113, 1806–1815. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.03.016 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Zekiri, F. et al. Reinigung und Charakterisierung von Tyrosinase aus Walnussblättern (Juglans regia). Phytochemie 101, 5–15. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2014.02.010 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heimdal, H., Larsen, LM & Poll, L. Charakterisierung von Polyphenoloxidase aus photosynthetischen und vaskulären Salatgeweben (Lactuca sativa). J. Agrar. Lebensmittelchem. 42, 1428–1433. https://doi.org/10.1021/jf00043a008 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Molitor, C., Mauracher, SG & Rompel, A. Kristallisation und vorläufige kristallographische Analyse der latenten, aktiven und rekombinant exprimierten Auronsynthase, einer Polyphenoloxidase aus Coreopsis grandiflora. Acta Cryst. F-Struktur. Biol. Komm. 71, 746–751. https://doi.org/10.1107/S2053230X1500754 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Fraignier, M., Marques, L., Fleuriet, A. & Macheix, J. Biochemische und immunchemische Eigenschaften von Polyphenoloxidasen aus verschiedenen Früchten von Prunus. J. Agrar. Lebensmittelchem. 43, 2375–2380. https://doi.org/10.1021/jf00057a011 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Robinson, H. et al. Strukturelle Grundlage der Elektronentransfermodulation im violetten Cu A-Zentrum. Biochemie 38, 5677–5683. https://doi.org/10.1021/bi9901634 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Saba, MK & Moradi, S. Interne Bräunungsstörung von acht Birnensorten, die durch bioaktive Bestandteile und Enzymaktivität beeinflusst werden. Lebensmittelchem. 205, 257–263. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.03.022 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. & García-Carmona, F. Teilweise Reinigung von löslicher Kartoffel-Polyphenoloxidase durch Verteilung in einem wässrigen Zweiphasensystem. J. Agrar. Lebensmittelchem. 41, 1219–1224. https://doi.org/10.1021/jf00032a010 (1995).

Artikel Google Scholar

Reinkensmeier, A. et al. Überwachung der Apfel-Polyphenoloxidase-modulierten Adduktbildung von Phenol- und Aminoverbindungen. Lebensmittelchem. 194, 76–85. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.07.145 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Docimo, T. et al. Einblicke in die Bräunungsmechanismen des Fruchtfleisches in genetischen Linien von Solanum melongena mit entgegengesetztem Verhalten nach dem Schnitt. J. Agrar. Lebensmittelchem. 64, 4675–4685. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b00662 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miller, AR, Kelley, TJ & Mujer, CV Anodische Peroxidase-Isoenzyme und Polyphenoloxidase-Aktivität aus Gurkenfrüchten: Gewebe- und Substratspezifität. Phytochemie 29, 705–709. https://doi.org/10.1016/0031-9422(90)80005-2 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Yue-Ming, J. Reinigung und einige Eigenschaften der Polyphenoloxidase von Longanfrüchten. Lebensmittelchem. 66, 75–79. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(98)00242-8 (1999).

Artikel Google Scholar

Sun, J. et al. Vergleich der Charakterisierung von Longan-Polyphenoloxidase (Dimocarpus longan Lour.) unter Verwendung endogener und exogener Substrate. J. Agrar. Lebensmittelchem. 58, 10195–10201. https://doi.org/10.1021/jf101639d (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Qilin, T., Yuling, L., Qingyou, Z., Rongfeng, S. & Zhongxiong, L. Klonierung und Expressionsanalysen von DlPPO1 aus Dimocarpus Longan Lour. Acta Bot. Boreal. Okzid. Sünde. 36, 1098–1104 (2016).

Google Scholar

Midorikawa, T. & Inoue, K. Mehrere Schicksale nichtreifer Lumenproteine ​​in Thylakoiden. Anlage. J. 76, 73–86. https://doi.org/10.1111/tpj.12273 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. & Rompel, A. Drei rekombinant exprimierte Apfeltyrosinasen legen die Aminosäuren nahe, die für die Mono- gegenüber Diphenolase-Aktivität in pflanzlichen Polyphenoloxidasen verantwortlich sind. Wissenschaft. Rep. 7, 8860. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08097-5 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panis, F. & Rompel, A. Identifizierung der Aminosäureposition, die die verschiedenen enzymatischen Aktivitäten in Walnuss-Tyrosinase-Isoenzymen (jrPPO1 und jrPPO2) steuert. Wissenschaft. Rep. 10, 10813. https://doi.org/10.1038/s41598-020-67415-6 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panis, F., Krachler, RF, Krachler, R. & Rompel, A. Expression, Reinigung und Charakterisierung einer gut angepassten Tyrosinase aus Torfgebieten, identifiziert durch partielle Gemeinschaftsanalyse. Umgebung. Wissenschaft. Technol. 55, 11445–11454. https://doi.org/10.1021/acs.est.1c02514 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Biundo, A. et al. Polyphenoloxidasen weisen eine promiskuitive proteolytische Aktivität auf. Komm. Chem. 3, 62. https://doi.org/10.1038/s42004-020-0305-2 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Lee, N., Lee, SH, Baek, K. & Kim, BG Heterologe Expression von Tyrosinase (MelC2) aus Streptomyces avermitilis MA4680 in E. coli und ihre Anwendung für die ortho-Hydroxylierung von Resveratrol zur Herstellung von Piceatannol. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 99, 7915–7924. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6691-1 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moe, LL, Maekawa, S. & Kawamura-Konishi, Y. Die C-terminale Prozessierungsdomäne des Proenzyms der Pholiota nameko-Tyrosinase ist für die Faltung der N-terminalen katalytischen Domäne verantwortlich. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 99, 5499–5510. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6597-y (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, Y. et al. Ein Ansatz zur rekombinanten Herstellung reifer Trauben-Polyphenoloxidase. Biochemie 165, 40–47. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.002 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hanna, PM, Tamilarasan, R. & McMillin, DR Cu(I)-Analyse von blauen Kupferproteinen. Biochem. J. 256, 1001–1004. https://doi.org/10.1042/bj2561001 (1988).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meija, J. et al. Isotopenzusammensetzungen der Elemente 2013 (IUPAC Technical Report). Reine Appl. Chem. 88, 293–306. https://doi.org/10.1515/pac-2015-0503 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Ericsson, UB, Hallberg, BM, DeTitta, GT, Dekker, N. & Nordlund, P. Thermofluorbasierte Hochdurchsatz-Stabilitätsoptimierung von Proteinen für Strukturstudien. Anal. Biochem. 357, 289–298. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.07.027 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marques, L., Fleuriet, A. & Macheix, J. Charakterisierung mehrerer Formen von Polyphenoloxidase aus Apfelfrüchten. Pflanzenphysiologie. Biochem. 33, 193–200 (1995).

CAS Google Scholar

Mari, S., Marques, L., Breton, F., Karamanos, Y. & Macheix, J. Entfaltung und Rückfaltung der aktiven Apfel-Polyphenoloxidase. Phytochemie 49, 1213–1217. https://doi.org/10.1016/s0031-9422(98)00142-3' (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moore, BM & Flurkey, WH Natriumdodecylsulfat-Aktivierung einer pflanzlichen Polyphenoloxidase. Wirkung von Natriumdodecylsulfat auf die enzymatischen und physikalischen Eigenschaften der gereinigten Polyphenoloxidase aus Saubohnen. J. Biol. Chem. 265, 4982–4988. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)34072-4 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Robb, DA, Mapson, LW & Swain, T. Aktivierung der latenten Tyrosinase der Saubohne. Natur 201, 503–504. https://doi.org/10.1038/201503b0 (1964).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Sánchez-Ferrer, A., Villalba, J. & García-Carmona, F. Triton X-114 als Hilfsmittel zur Reinigung von Spinat-Polyphenoloxidase. Phytochemie 28, 1321–1325. https://doi.org/10.1016/S0031-9422(00)97738-0 (1989).

Artikel Google Scholar

Espín, JC & Wichers, HJ Aktivierung einer latenten Pilz-Tyrosinase-Isoform (Agaricus bisporus) durch Natriumdodecylsulfat (SDS). Kinetische Eigenschaften der SDS-aktivierten Isoform. J. Agrar. Lebensmittelchem. 47, 3518–3525. https://doi.org/10.1021/jf981275p (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Escribano, J., Cabanes, J., Chazarra, S. & García-Carmona, F. Charakterisierung der Monophenolaseaktivität von Tafelrübenpolyphenol. Oxidase Bestimmung kinetischer Parameter des Tyramin/Dopamin-Paares. J. Agrar. Lebensmittelchem. 45, 4209–4214. https://doi.org/10.1021/jf970384l (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Laveda, F., Núñez-Delicado, E., García-Carmona, F. & Sánchez-Ferrer, A. Reversible Natriumdodecylsulfat-Aktivierung der latenten Pfirsich-Polyphenoloxidase durch Cyclodextrine. Bogen. Biochem. Biophys. 379, 1–6. https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1838 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Robinson, S., Loveys, B. & Chacko, E. Polyphenoloxidase-Enzyme im Saft und in der Schale von Mangofrüchten. Funktion. Pflanzenbiol. 20, 99. https://doi.org/10.1071/PP9930099 (1993).

Artikel CAS Google Scholar

Leufken, CM, Moerschbacher, BM & Dirks-Hofmeister, ME Löwenzahn-PPO-1/PPO-2-Domänenaustausch: Die C-terminale Domäne moduliert das pH-Optimum und der Linker beeinflusst die SDS-vermittelte Aktivierung und Stabilität. Biochim. Biophys. Acta – Proteins Proteomics 1854, 178–186. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2014.11.007 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Yoruk, R. & Marshall, MR Physikochemische Eigenschaften und Funktion der pflanzlichen Polyphenoloxidase: Eine Übersicht. J. Lebensmittelbiochem. 27, 361–422. https://doi.org/10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Ito, M. & Oda, K. Eine gegen organische Lösungsmittel resistente Tyrosinase aus Streptomyces sp. REN-21: Reinigung und Charakterisierung. Biowissenschaften. Biotechnologie. Biochem. 64, 261–267. https://doi.org/10.1271/bbb.64.261 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mishra, BB, Gautam, S. & Sharma, A. Reinigung und Charakterisierung von Polyphenoloxidase (PPO) aus Auberginen (Solanum melongena). Lebensmittelchem. 134, 1855–1861. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.03.098 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rompel, A. et al. Reinigung und spektroskopische Untersuchungen an Catecholoxidasen aus Lycopus europaeus und Populus nigra: Hinweise auf ein zweikerniges Kupferzentrum vom Typ 3 und spektroskopische Ähnlichkeiten mit Tyrosinase und Hämocyanin. J. Biol. Inorg. Chem. 4, 56–63. https://doi.org/10.1007/s007750050289 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rompel, A., Büldt-Karentzopoulos, K., Molitor, C. & Krebs, B. Reinigung und spektroskopische Untersuchungen an Catecholoxidase aus Zitronenmelisse (Melissa officinalis). Phytochemie 81, 19–23. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2012.05.022 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eicken, C., Zippel, F., Büldt-Karentzopoulos, K. & Krebs, B. Biochemische und spektroskopische Charakterisierung der Catecholoxidase aus Süßkartoffeln (Ipomoea batatas), die ein Typ-3-Dikupferzentrum enthalten. FEBS Lett. 436, 293–299. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(98)01113-2 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kampatsikas, I., Pretzler, M. & Rompel, A. Identifizierung von Aminosäureresten, die für die CH-Aktivierung in Typ-III-Kupferenzymen verantwortlich sind, indem sie Tyrosinaseaktivität in einer Catecholoxidase erzeugen. Angew. Chem. Int. Ed. 59, 20940–20945. https://doi.org/10.1002/anie.202008859 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Kampatsikas, I., Pretzler, M. & Rompel, A. Die Erzeugung von Tyrosinaseaktivität in einer Catecholoxidase erlaubt die Identifizierung der für die C-H-Aktivierung in Typ-III-Kupferenzymen verantwortlichen Aminosäurereste. Angew. Chem. 132, 21126–21131. https://doi.org/10.1002/ange.202008859 (2020).

Artikel ADS Google Scholar

Trott, O. & Olson, AJ Software-Neuigkeiten und -Updates AutoDock Vina: Verbesserung der Geschwindigkeit und Genauigkeit des Andockens mit einer neuen Bewertungsfunktion, effizienter Optimierung und Multithreading. J. Comput. Chem. 31, 455–461. https://doi.org/10.1002/jcc.21334 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaintz, C., Mayer, RL, Jirsa, F., Halbwirth, H. & Rompel, A. Ortsgerichtete Mutagenese um die CuA-Stelle einer Polyphenoloxidase aus Coreopsis grandiflora (cgAUS1). FEBS Lett. Rev. 589, 789–797. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.02.009 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gambino, G., Perrone, I. & Gribaudo, I. Eine schnelle und effektive Methode zur RNA-Extraktion aus verschiedenen Geweben von Weinreben und anderen Holzpflanzen. Phytochem. Anal. 525, 520–525. https://doi.org/10.1002/pca.1078 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Swinehart, DF Das Beer-Lambert-Gesetz. J. Chem. Educ. 39, 333–335. https://doi.org/10.1021/ed039p333 (1962).

Artikel CAS Google Scholar

Gasteiger, E. et al. Tools zur Proteinidentifizierung und -analyse auf dem ExPASy-Server. In The Proteomics Protocols Handbook (Hrsg. Walker, J.) (Humana Press, 2005).

Google Scholar

Laemmli, UK Spaltung von Strukturproteinen beim Aufbau des Kopfes des Bakteriophagen T4. Natur 227, 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0 (1979).

Artikel ADS Google Scholar

Marquardt, DW Ein Algorithmus zur Kleinste-Quadrate-Schätzung nichtlinearer Parameter. J. Soc. Ind. Appl. Mathematik. 11, 431–441. https://doi.org/10.1137/0111030 (1963).

Artikel MathSciNet MATH Google Scholar

Hanes, CS Studien zu Pflanzenamylasen. Biochem. J. 26, 1406–1421. https://doi.org/10.1042/bj0261406 (1932).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eickman, NC, Himmelwright, RS & Solomon, EI Geometrische und elektronische Struktur von Oxyhämocyanin: Spektrale und chemische Korrelationen zu Met-Apo-, Half-Met-, Met- und Dimer-aktiven Zentren. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 76, 2094–2098. https://doi.org/10.1073/pnas.76.5.2094 (1979).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J. & Schwede, T. Der SWISS-MODEL-Arbeitsbereich: Eine webbasierte Umgebung für die Modellierung der Proteinstrukturhomologie. Bioinformatik 22, 195–201. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti770 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bordoli, L. et al. Modellierung der Homologie der Proteinstruktur mit dem SWISS-MODEL-Arbeitsbereich. Nat. Protokoll. 4, 1–13. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.197 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Einfaches Suchwerkzeug für die lokale Ausrichtung. J. Mol. Biol. 215, 403–410. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Remmert, M., Biegert, A., Hauser, A. & Söding, J. HHblits: Blitzschnelle iterative Proteinsequenzsuche durch HMM-HMM-Alignment. Nat. Methoden 9, 173–175. https://doi.org/10.1038/nmeth.1818 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Das PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC.

Kim, S. et al. PubChem im Jahr 2021: Neue Dateninhalte und verbesserte Weboberflächen. Nukleinsäuren Res. 49, D1388–D1395. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa971 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Allouche, A. Software-Neuigkeiten und -Updates gabedit – Eine grafische Benutzeroberfläche für Computerchemie-Software. J. Comput. Chem. 32, 174–182. https://doi.org/10.1002/jcc.21600 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Wallace, AC, Laskowski, RA & Thornton, JM LIGPLOT: Ein Programm zur Erstellung schematischer Diagramme von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Protein Eng. 8, 127–134. https://doi.org/10.1093/protein/8.2.127 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: Multiple Ligand-Protein-Interaktionsdiagramme für die Arzneimittelentwicklung. J. Chem. Inf. Modell. 51, 2778–2786. https://doi.org/10.1021/ci200227u (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

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Fakultät für Chemie, Institut für Biophysikalische Chemie, Universität Wien, Josef-Holaubek-Platz 2, 1090, Wien, Austria

Leela Ruckthong, Matthias Pretzler, Ioannis Kampatsikas & Annette Rompel

Fakultät für Naturwissenschaften, Fachbereich Chemie, King Mongkut's University of Technology Thonburi (KMUTT), Thung Kru, Bangkok, 10140, Thailand

Leela Ruckthong

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LR-Konzeptualisierung: Unterstützend; Untersuchung: Leitung; Datenkuration: Unterstützend; Schreiben – Originalentwurf: Leitung; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: Leitung. MP-Konzeptualisierung: Unterstützend; Untersuchung: Unterstützend; Datenkuration: Leitung; Schreiben – Originalentwurf: Unterstützend; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: Unterstützend. IK-Konzeptualisierung: Leitung; Untersuchung: Unterstützend; Datenkuration: Unterstützend; Betreuung: Unterstützend; Schreiben – Originalentwurf: Unterstützend; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: Unterstützend. AR-Konzeptualisierung: Unterstützend; Finanzierungseinwerbung: Federführung; Projektleitung: Leitung; Aufsicht: Leitung; Schreiben – Originalentwurf: Unterstützend; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: Unterstützend. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Annette Rompel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Ruckthong, L., Pretzler, M., Kampatsikas, I. et al. Die biochemische Charakterisierung der Polyphenoloxidase aus Dimocarpus longan liefert Einblicke in ihre katalytische Effizienz. Sci Rep 12, 20322 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20616-7

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Eingegangen: 12. Juli 2022

Angenommen: 15. September 2022

Veröffentlicht: 25. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20616-7

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